服务介绍
亚克隆和载体构建是基因工程中常用的技术手段，主要用于将目的基因插入到载体DNA分子中，构建成重组DNA分子。亚克隆是将DNA分子从一个载体转移到另一个载体的过程，通常采用限制性内切酶切割DNA分子，将目的DNA片段插入到另一个载体中。载体构建是将目的基因插入到已有的载体分子中，通常通过PCR扩增和限制性内切酶切割等技术实现。这些技术在基因工程、生物制药、农业生产等领域都有着广泛的应用，为研究人员提供了一种有效而可靠的重组DNA分子构建方法
服务优势
- 金开瑞自主研发了高通量，低成本的载体构建技术，能快速高效的帮您构建感兴趣的多种载体，极大程度为您节约时间成本，让您宝贵的时间花在“刀刃上”。
服务流程
客户提供
客户提供目的序列信息；
目的序列需要插入的载体信息，包括序列，抗性，测序引物，克隆位点；
样品：
1）包含目的序列的模板质粒，模板质粒的抗性；
2）目的载体（金开瑞无法提供载体情况下）
模板质粒中包含目的基因序列这段的峰图格式测序报告（并非整个模板质粒的测序报告）
最终交付
- 约4 µg含有目的片段的高纯度冻干质粒DNA；
- 含有重组质粒的穿刺菌或甘油菌一管（默认菌株为TOP10具体以样品管壁标签为准）；
- 发货文件主要包括如下内容：测序结果、COA报告、sqd文件、seq文件。
服务说明
| 业务类型 | 基因长度 | 周期 |
| 亚克隆 | 0~1.5kb | 5-8 |
| 1.5kb~3kb | 7-10 | |
| 3kb~4kb | 8-13 | |
| 4kb~5kb | 10-15 | |
| 5kb~10kb | 咨询 | |
| 服务项目 | 基因长度 | 服务周期 |
| 载体构建 | 0-70bp | 7-10 |
相关资源
1、亚克隆实验步骤及注意事项
（1）实验步骤
①DNA片段制备：
● 确保选择正确的酶切酶和缓冲液，以确保准确的酶切反应。
● 根据实验需求，选择适当的酶切时间和温度。
● 注意避免DNA片段污染和降解，使用无菌和无核酸酶的实验操作。
②载体DNA准备：
● 确保载体DNA质量高，无降解和污染。
● 使用正确的酶切酶和缓冲液，以确保正确的酶切反应。
● 注意选择正确的酶切时间和温度，以避免过度酶切或不完全酶切。
③连接反应：
● 根据需要，选择适当的连接酶和缓冲液，并按照推荐的酶和DNA比例进行反应。
● 确保反应温度和时间适宜，以获得高效的连接效果。
● 考虑使用阳性和阴性对照进行验证连接反应的成功与否。
④转化：
● 根据实验目的选择合适的转化方法（如化学转化、电穿孔等）。
● 严格控制转化条件，包括细胞的生长状态、转化时间和DNA的浓度等。
● 根据不同细胞类型的要求，选择合适的培养基和培养条件。
⑤筛选与鉴定：
● 根据实验设计，使用适当的筛选标记（如抗生素抗性基因）进行转化子的筛选。
● 进行PCR扩增和测序分析，以确认所获得的克隆是否包含目标DNA序列。
● 进行限制性酶切鉴定或其他分子生物学方法，验证重组DNA的准确性和完整性。
（2）注意事项：
● 严格遵守实验室的安全操作规范，使用无菌和无核酸酶的实验操作。
● 注意实验中的温度、时间、酶切酶和缓冲液的选择，以确保反应的准确性和高效性。
● 使用正确的阳性和阴性对照，确保实验结果的可靠性。
● 在转化和筛选过程中，注意细胞的生长状态和培养条件，以确保转化效率和克隆的存活率.
2、不同转化方法的简介及优劣势对比
| 转化方法 |
简介 |
优势 | 劣势 | 示例 |
| 热激转化法 | 利用高温冲击使细胞膜通透，导入外源DNA | 简单易行，适用于多种微生物 | 转化效率较低，可能对细胞产生损伤 | 将外源DNA加入大肠杆菌中进行转化 |
| 电穿孔法 | 通过电场脉冲使细胞膜形成孔隙，使DNA进入细胞 | 适用于多种细胞类型，转化效率高 | 需要专门设备，可能对细胞产生损伤 | 用电穿孔仪对哺乳动物细胞进行转化 |
| 钙离子共沉淀法 | 利用钙离子和DNA共同沉淀，通过吸附实现转化 | 操作简单，适用于多种细胞类型 | 转化效率相对较低，需要特定缓冲液 | 用钙离子法将DNA转化至昆虫细胞 |
| 脂质体转染法 | 利用脂质体封装外源DNA，与细胞膜融合实现转化 | 适用于多种细胞类型，转化效率高 | 成本较高，复杂操作步骤 | 使用脂质体转染法将DNA转化至培养的哺乳动物细胞 |
| 生物素化转染法 | 利用生物素化技术将DNA与生物素结合，与目标细胞特异性结合实现转化 | 可实现细胞特异性转化，转化效率较高 | 增加实验成本，结合稳定性需考虑 | 利用生物素化转染法将DNA转化至特定细胞亚群 |
| 离子转染法 | 利用离子的作用使细胞膜通透性增加，使DNA进入细胞 | 适用于多种细胞类型，转化效率较高 | 需要优化离子条件，离子毒性问题 | 利用离子转染法将DNA转化至植物细胞 |
常用的载体验证方法
● 酶切鉴定：通过对构建的载体进行限制酶切消化，验证目标基因是否正确插入载体。将载体与适当的限制酶一起切割，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，观察目标片段的出现。
● PCR验证：使用引物对构建的载体进行PCR扩增，检测目标基因的存在。通过设计引物，可选择性扩增目标基因片段，并通过琼脂糖凝胶电泳分析确认扩增产物的大小。
● DNA测序：进行构建的载体进行全序列或部分序列测序，以验证目标基因的正确性和序列准确性。通过与设计的序列进行比对，确认插入的目标基因是否与预期一致。
● 蛋白质表达验证：将构建的载体转化至适当的宿主细胞中，并通过蛋白质表达分析确认目标基因的蛋白质表达情况。可通过Western blot、ELISA等方法检测目标蛋白质的表达水平和纯度。
● 功能性验证：根据载体的功能设计相应的实验验证。例如，如果载体是用于表达蛋白质的，可以通过功能性分析，如酶活性测定、细胞增殖或细胞凋亡实验等，验证目标基因的功能。
以上方法可以单独或结合使用，以确保构建的重组载体的正确性和功能性。在进行载体验证时，注意选择合适的实验方法和控制组，严格操作实验步骤，以获得可靠的结果。
