CO-IP

CO-IP

  • 蛋白质复合物鉴定
  • 蛋白质相互作用
  • 信号传导研究
  • 疾病机制解析

服务特色

Co-IP技术是研究蛋白质相互作用的重要方法之一,通过对蛋白质复合物的免疫沉淀和分析,可以揭示蛋白质相互作用的组成和功能,为理解生物过程和疾病机制提供重要的信息。

服务介绍

免疫共沉淀技术(co-Immunoprecipitation,co-IP)是一种研究两种蛋白在体内是否存在相互作用的有效方法,通过抗体和已知蛋白结合,从而捕获整个已知蛋白复合物,进而研究复合物中与已知蛋白存在相互作用的蛋白。

服务优势

  • 直接检测蛋白质与其他分子(如蛋白质、DNA或RNA)之间的相互作用,提供了定性和定量信息。
  • 可以在原生条件下进行,更接近细胞内环境,有助于揭示生物体内的相互作用。
  • 可以研究复杂的蛋白质复合物,包括多个亚基或较大的蛋白质复合物。
  • 可以通过验证和功能研究进一步验证相互作用的生物学功能。

服务流程

接收订单及样品
样品裂解液制备、定量
样品、抗体、protein A/G-凝胶孵育
沉淀收集、洗涤、制样
WB检测
结果交付

客户提供

1、需检测的样品,一抗(也可以选择由金开瑞提供)。

2、送样要求:

▶ 离体后迅速超低温处理并-80℃冻存的组织样品,干冰运输;

▶ 组织:动物组织不少于400 mg;植物组织不少于2 g;

▶ 细胞:2x10^7个细胞。

服务说明

服务名称 服务内容 交付内容及标准 服务周期(工作日)
免疫共沉淀Co-IP 蛋白提取 1 个样本 16
Co-IP前wb 跑胶1个泳道
Co-IP 富集2次:IgG、IP各1次
Co-IP后诱饵蛋白wb 跑胶3个泳道:IgG、IP、input
SDS-PAGE银染 跑胶3个泳道:IgG、IP、input 4
质谱鉴定互作蛋白 质谱鉴定:IgG、IP 10-15

案例展示

常见问题与解析 (Q&A)

Q:coIP的应用?

免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)是利用抗原抗体特异性反应纯化富集样品中目的蛋白的一种方法。通常使目标蛋白同抗体-protein A/G形成免疫复合物沉淀而得以收集,然后通过WB检测目的蛋白。 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CO-IP)是将样品中同抗体靶蛋白相互作用的蛋白一同随免疫复合物沉淀,可以检测两种目标蛋白质是否在体内存在相互作用,也可以确定一种蛋白在体内的相互作用蛋白。

Q:coIP需要准备多少样本量?

coIP实验需要保证足够的蛋白浓度才能维持原本存在的蛋白互作状态,尤其当蛋白丰度较低、相互作用力不强、使用不易提蛋白组织等情况时。而且coIP的实验条件往往需要反复摸索。因此用于coIP实验需准备细胞>2x107,动物组织>500mg,植物组织>2g,并且须更加注意采集后速冻-80℃保存和避免反复冻融。

Q: coIP实验成败的主要因素?

a.所使用的抗体不仅需要优秀的亲和力、特异性,其识别表位还可能被互作蛋白所掩蔽(主要是使用单抗时); b.当蛋白互作须发生在特定生理代谢条件、组织细胞类型之中时,coIP实验可能无法获得互作结果; c.如果诱饵蛋白和或捕获蛋白在样本中丰度很低时; d.两个互作蛋白的亲和力较弱; e.当该蛋白互作需要较特定的离子强度,或者需要如Ca离子/Mg离子/ATP等辅因子时,要创造合适的反应条件会变得困难; f.一些样品处理提取存在难度,提取足量目的蛋白与保持蛋白天然状态,需通过实验条件达到优化平衡; g.外源表达的标签蛋白存在同内源蛋白的位点竞争,这主要在使用标签抗体进行实验时可能存在。

Q:CoIP实验成功的评判标准是什么?

在coIP-WB鉴定结果中,IgG组无目的蛋白条带、IP组有目的蛋白条带,说明IP过程成功;银染胶图中,IP组相对于IgG组有更多蛋白条带、且存在差异,说明coIP过程捕获到互作蛋白;IP产物在质谱检测中鉴定到的蛋白数量不能作为判断实验成败的标准,因为这取决于目的蛋白本身所具有的互作蛋白数量、结合力强弱等方面;IP产物的质谱鉴定数量越多并不代表结果越好。

相关技术服务

相关资源

1、Co-IP的实验步骤

    ● 细胞提取:从细胞或组织中提取蛋白质,可以使用细胞裂解缓冲液来破裂细胞膜,并添加蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂来保护蛋白质的完整性。

    ● 抗体固定:将目标蛋白质的抗体与磁珠或琼脂糖小球等固相材料结合,形成抗体固定的材料。

    ● 免疫沉淀:将细胞提取物与抗体固定的材料一起孵育,使目标蛋白质与其结合伙伴形成复合物。

    ● 洗涤:将反应混合物进行多次洗涤,以去除非特异性结合的蛋白质和杂质。

    ● 洗脱:通过改变pH、离子强度或添加竞争剂等方式,将复合物从抗体固定材料上洗脱下来。

    ● 蛋白质分析:对洗脱的样品进行蛋白质分析,可以使用SDS-PAGE和免疫印迹等技术检测目标蛋白质及其结合伙伴的存在。

 

2、Co-IP的应用场景

    ● 揭示蛋白质复合物的组成和功能:Co-IP技术可以用于鉴定蛋白质复合物的组成和结构。通过选择特定的目标蛋白质作为抗体的靶点,可以将其与其他相互作用蛋白质共沉淀,从而确定蛋白质复合物的组成。这有助于理解蛋白质复合物在细胞内的功能、相互作用网络和信号传导通路。

    ● 研究信号传导和基因调控:Co-IP技术可用于研究蛋白质在信号传导和基因调控中的相互作用。例如,可以通过共沉淀实验来确定转录因子与DNA序列的结合,并揭示基因调控的机制。此外,Co-IP还可用于研究蛋白质激酶和底物之间的相互作用,从而了解细胞信号传导通路的调控机制。

    ● 鉴定疾病相关的蛋白质复合物:Co-IP技术可用于鉴定与疾病相关的蛋白质复合物。通过将目标蛋白质与疾病相关的样本共沉淀,可以发现与疾病发生和发展相关的蛋白质相互作用。这有助于理解疾病的发病机制、寻找潜在的治疗靶点,并为药物开发和治疗策略提供重要的线索。

    ● 蛋白质交互作用网络分析:通过大规模的Co-IP实验和蛋白质组学技术结合,可以构建蛋白质交互作用网络图谱。这些网络图谱提供了蛋白质相互作用网络的全貌,有助于了解细胞内蛋白质相互作用网络的结构和功能。这对于研究细胞过程、生物学调控和疾病机制等具有重要的意义。

 

3、与Co-IP技术相关的常见问题与解答

(1)    Co-IP实验中如何选择合适的抗体?

    ▶ 选择具有高亲和力和特异性的抗体,最好是经过验证的商业抗体或有良好文献支持的自制抗体。

    ▶ 针对目标蛋白质选择不同的克隆,进行抗体特异性验证,如Western blotting。

    ▶ 进行预实验,评估抗体的适用性和效果。

 

(2)    如何优化Co-IP实验条件以提高效率和特异性?

    ▶ 优化提取和溶解条件,使用合适的缓冲液和洗涤液来提高蛋白质的溶解和纯化效率。

    ▶ 调整孵育时间和温度,以优化抗体与靶蛋白质的结合。

    ▶ 增加洗涤步骤,以去除非特异性结合的蛋白质。

    ▶ 使用阻断剂,如牛血清蛋白(BSA)或鱼精蛋白(Gelatin),减少非特异性结合。

 

(3)    如何解释Co-IP实验结果中的负面数据或低信号?

    ▶ 检查实验条件和步骤是否正确,如蛋白质提取、溶解、抗体结合等。

    ▶ 评估抗体的质量和特异性,进行抗体验证实验,如Western blotting。

    ▶ 重新评估目标蛋白质的表达水平,确定其是否充分表达。

    ▶ 检查Co-IP实验条件是否适当,可能需要调整抗体浓度、孵育时间等。

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