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关于酵母杂交文库构建及筛选你需要知道这些
文章来源:genecreate 作者:genecreate 发布时间:2021-04-02 10:41
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。


酵母单杂交技术

 

 
二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测蛋白质相互作用的研究方法,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。

 

核蛋白酵母双杂交:
 
 

 

核蛋白酵母双杂交技术最初由Fields等人在研究酵母转录因子GAL4性质时建立,后续经过不断改进已发展成为一种成熟的蛋白-蛋白互作研究工具,具有简便、灵敏、可反映蛋白在活细胞内互作真实情况的特点,被广泛应用于互作蛋白的筛选、蛋白相互作用的鉴定/验证、蛋白互作机理的探究、蛋白连锁图谱绘制等工作。

 

 

膜蛋白酵母双杂交:
 
 

 

DUALmembrane技术在传统的酵母双杂交系统的基础上,巧妙地利用分离的泛素系统(split-ubiquitin)进行蛋白质相互作用的筛选;泛素作为降解信号分子,人为分成两部分:N端(Nub),C端(Cub),互补重构的完整泛素分子可被泛素专一性蛋白酶(UBPs)识别,从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。

 

 
 
多领域的研究利器

 

植物:自交不亲和机理研究……

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选……

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选……

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选……

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选……

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育…….

 
金开瑞提供从总RNA到mRNA到双链合成和纯化再到文库正式质控的全套质控结果
 
100%质控标准,全方位保证文库质量

有时候,制定计划会让我们觉得繁琐而不去实行,然而实际上,这2%的时间常常有不亚于 10%的效果,它不仅帮助我们节约了做任务时 的边际时间,还带给我们一种踏实感。“先做了再说”和“胸有成竹”地做效率是截然不同的。

酵母双杂交

 
 
独特的技术优势

一站式辅助检测手段方便快捷,得到可靠的实验结论;多年文库构建经验,4种优化的Total RNA提取技术方案可以有效保证Total RNA的纯度和完整性,保证样本的多样性;

高效的SM定向三框文库构建技术可以保证文库的阳性率在98%以上,且一份cDNA样本连接三个不同的读码框载体可以轻松实现三框文库的质控指标零差异,减少文库差异对筛选结果的影响;

定向改造了pPR3-N系列载体为pPR3-GW载体,可以轻松实现核蛋白文库到膜蛋白文库的一步LR反应,获得膜蛋白酵母双杂交文库。

 
文库构建策略比较

 
案例展示

文库构建质控结果:

 

 

从质控的结果上看,文库的插入片段分布在1500bp左右,阳性率为100%

 

高效的一步文库筛选结果:

 

 

从文库筛选质控结果上看,筛选到的阳性克隆片段大小不一,插入片段分布在800~1500bp。

 
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常见Q&A
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1.Q: 酵母双杂交的筛选流程?

A: 将已知基因作为诱饵,在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白,从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY质粒,对质粒中的cDNA片段进行测序,并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较,研究与已知基因在生物学功能上的联系。

 

2. Q: 酵母杂交技术有哪些优势?

A: a.体内的互作验证,省去蛋白表达、纯化等步骤;b. 细胞内验证,在一定程度上反应细胞内的真实情况;c. 可以检测微弱的蛋白互作;d. 可对不同组织、器官、细胞、分化阶段材料进行文库构建和筛选

 

3.Q:如何确定是选择构建核体系文库还是膜体系文库?

A: 如果诱饵基因是定位在膜上的蛋白则选择膜体系文库,如果诱饵基因是定位于核则选择核体系文库,如果诱饵基因有跨膜区也可以考虑把跨膜区切除以后用核体系文库筛库,但是这样操作有一定风险。

 

4.Q: 如果诱饵蛋白能够直接激活报告基因的表达,改如何处理?

A: 该蛋白很可能是转录因子,具有转录激活域。可以通过基因重组切掉转录激活域,然后重新检测其是否自激活。但是要注意重组也有可能破坏蛋白之间的互作。

 

5.Q: 杂交效率不高,怎么办?

A: 在杂交中,预转化的诱饵细胞的数量可能不够。当对诱饵菌株进行液体培养过夜时,应挑选大的、新鲜的克隆进行培养,经过离心和重悬后,再使用血球计对细胞进行计数,提高杂交效率。

 

6.Q: 酵母双杂交出现假阳性的原因?如何解决?

A: 由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用,或者其激活作用被外来蛋白激活。AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合,则也可单独激活报告基因的表达。因此,需要作严格的对照试验,对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定,以排除假阳性。也可以采用多个报告基因,且每个报告基因的上游调控区各不相同,这可减少大量的假阳性。另外,报告基因整合到染色体上,可以使基因表达水平稳定,消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。

 

7.Q: 酵母双杂交系统有哪些应用?

A: a.发现新的蛋白质和蛋白质的新功能;b. 在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用;c. 筛选药物的作用位点;d. 建立基因组蛋白连锁图

 

8. Q: 金开瑞酵母双杂交有哪些优势?

A: a.我们会进行自激活及毒性检测;b. 文库构建,我们采用纯化分离mRNA材料建库,增加了文库样本的有效性,5’端引物设计保证N端序列的有效性;c. 文库容量达标(>1*107cfu/mL)。

 

 

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