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行走江湖必备,轻松搞定自激活
文章来源:genecreate 作者:genecreate 发布时间:2021-11-30 16:52

在之前的文章中,我们总结了酵母杂交中的常见问题和解析,但是我们发现很多同学对自激活现象存在诸多疑问,那本期图文我们将对自激活的产生原因以及应对策略进行详细描述希望能给大家带来帮助。

 

酵母转录因子(GAL4)包括:

①DNA 结合结构域(DNA binding domain,BD;识别结合GAL4效应基因上游激活序列UAS)

②转录激活域(transcription activation domain ,AD;与转录机构中的其他成分结合作用启动下游的基因进行转录)

 

技术原理:2个结构域彼此分离但为功能必需的结构域,单独作用不能激活转录反应,当二者在空间上充分接近时,则呈现完整的GAL4转录因子活性使启动子下游基因(抗性筛选、蓝白斑筛选、营养缺陷型筛选等)得到转录。把需要检测的蛋白质分别与BD和AD融合,形成 bait 融合蛋白(BD- bait)和 prey 融合蛋白(AD-prey),如果 bait 和 prey发生相互作用,就会促使 BD 和 AD 在空间上相互接近,形成完整的GAL4,激活报告基因的转录。

 

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一般情况下单独的BD可以与GAL4上游活化序列结合,但不能引起转录。如果,把一段具有转录激活活性的基因构建到BD的载体上,BD- bait会形成完整的激活转录作用,引起下游报告基因的转录和表达,这就是酵母杂交的自激活现象。那对于BD- bait可以直接激活报告基因,研究者们都在思考怎样解决问题。

 

双杂有4个独立的报告基因:
(1) AUR1-C: 是AUR1 的突变体,编码肌醇磷酸化酰胺合成酶,表达产物可以使酵母菌对AbA产生抗性,只有产生蛋白互作的时候才会被激活。
(2) HIS3:Y2HGold不能合成组氨酸,因此不能在缺乏这种必需氨基酸的培养基上生长。两种蛋白质相互作用时,His3表达被激活,允许酵母菌合成组氨酸并在其最基础的培养基上生长,3’AT作为HIS的抑制剂。
(3) ADE2: Y2HGold不能在不含腺嘌呤的最基础培养基上生长。当两种蛋白质相互作用时,Ade2表达被激活,使这些细胞在Ade最小培养基上生长。
(4) MEL1:编码α-半乳糖苷酶,由于蛋白间的相互作用,α-半乳糖苷酶由酵母细胞表达和分泌,使底物X-α-Gal变成蓝色。

 

为保证诱饵蛋白功能的完整性,首先我们会考虑用3’AT或者AbA进行自激活的抑制,但是由于这两种试剂对酵母生长具有一定的影响,浓度过高可能会影响后续的文库筛选及杂交验证,因此在3’AT超过15mM,AbA超过1200ng/ml时我们会考虑将诱饵蛋白进行截断。

 

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