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知无不“研”，DNA pull down 常见疑点解析

信息来源：金开瑞 作者：genecreate 发布时间：2020-11-17 10:11:17

DNA pull down 常见疑点解析
 
Q1： 适配子DNA单链，可以用带有互补链的磁珠进行pull down吗？如果可以，效率怎么样？一般需要怎么优化条件？
A：理论上说,若DNA单链能够与磁珠上的互补链杂交成功,是可以进行pull down实验的; 效率如何不好确定,这个取决于两条DNA单链是否能杂交成功、蛋白-DNA结合的强弱、蛋白的丰度等。
 
Q2： DNA pull down的 原理？
A：针对目标区域设计特异性DNA探针并进行生物素标记，生物素探针可与偶联在磁珠上的链霉亲和素结合；细胞蛋白提取物与磁珠-DNA探针孵育，从而钓取与DNA探针有特异性结合的互作蛋白质。
 
Q3： 你们对外服务的检测项目有哪些？
A：细胞、动物/植物组织、菌体都可以做DNA pull down, 我们还可以做的检测实验具体如下:
(1) RNA-蛋白/RNA互作及定位：RNA pull down、RIP、fish等;
(2) DNA-蛋白互作：DNA pull down、ChIP、EMSA、双荧光素酶、酵母单杂等;
(3) 蛋白-蛋白互作：GST/his pull down、CoIP、酵母双杂等;
(4) 细胞学检测：细胞增殖-MTT/CCK-8, 细胞凋亡, 细胞周期,细胞迁移、侵袭：划痕愈合/Transwell/Transwell（Matrigel）等;
(5) 外泌体服务：提取、鉴定(Nanosight粒径检测/电镜/WB)、
测序(miRNA/lncRNA)、蛋白质组学;
(6) 转录组及蛋白质组：真核有参转录组、无参转录组、真核lncRNA、small RNA等。
 
Q4：效率有多高？
A：效率主要取决于蛋白-DNA结合的强弱、蛋白的丰度等。
 
Q5：老师，对照组的DNA序列是怎么选择的？
A：一般对照组是没有探针的,对照组是磁珠beads+蛋白。
 
Q6：DNA pull down有什么缺陷吗？
A：DNA pull down-MS是体外研究蛋白-DNA是否有直接互作的经典技术，是将探针结合在凝胶/磁珠上，钓取与DNA探针有互作的蛋白；就技术而言,没有明显的缺陷;后续质谱能鉴定到多少蛋白取决于蛋白-DNA结合的强弱、蛋白的丰度等。
 
Q7： 做DNA pulldown 用DNA单链好还是双链好？
A：常规的是用DNA双链作为探针。
 
Q8： 可以简单讲一下生物素标记引物的原理吗？
A：主要利用生物素（biotin）和亲和素（avidin）这两种分子的独特性质; 亲和素的每个亚基都能结合一个生物素分子,两者的结合是通过生物素的脲基环部分完成的;因此可将其戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。
 
Q9： 如果做转录因子，转录因子和DNA结合发起转录，不应是和打开的单链结合吗?
A：启动子是位于转录起始位点（结构基因）5'端上游的DNA序列，就像"开关"，决定基因的活动，本身并不控制基因活动，而是通过与特定蛋白质（转录因子）结合而控制基因的活动。转录因子就像一面"旗子"，指挥着酶(enzymes)(RNA聚合酶polymerases) 的活动，这种酶制造着基因的RNA复制本。转录因子是与启动子DNA双链结合的。
 
Q10：做100bp突变对照组应该怎么突变碱基？
A：可以通过查找相关资料确定启动子发挥功能的核心区域,将核心区域进行突变;一般是A/G互换,C/T互换突变。
 
Q11： DNA互补链可以相互钓取吗？
A：DNA pull down 是研究蛋白-DNA的互作,不可以用DNA互补链相互钓取。
 
Q12：请问DNA为什么会与蛋白质互作呢，它们有什么功能的联系吗？
A：DNA pulldown 是研究蛋白-DNA的互作, 主要应用于寻找已知的启动子序列所结合的未知蛋白（转录因子）；启动子是位于转录起始位点（结构基因）5'端上游的DNA序列，就像"开关"，决定基因的活动，本身并不控制基因活动，而是通过与特定蛋白质（转录因子）结合而控制基因的活动。
 
Q13： 如果做小肽对细菌的作用是否也可以DNA pull down？
A：小肽属于蛋白类, 做不了DNA pull down。
 
Q14：未加探针的对照组鉴定出蛋白是什么原因呢？
A：对照组是磁珠beads+蛋白，虽然没有探针，但少量蛋白可以与磁珠相结合，对照组鉴定到的蛋白是非特异性的背景蛋白。
 
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