【支招】膜体系酵母双杂载体怎么选?
书接上文,上回我们聊到了酵母杂交自激活现象的产生原因及其应对策略,这期我们来唠一唠膜体系酵母双杂载体怎么选择。
DUAL membrane 系统(DUAL membrane system)首先由瑞士的Dualsystems Biotech AG 公司开发出来,是基于分离的泛素(split-ubiquitin)介导的膜蛋白酵母双杂交系统。可介导蛋白降解的泛素(ubiquitin)被分为:
①Cub(C端结构域)
②Nub(N端结构域):第三位的I被突变为G得到NubG,NubG在bait和prey互作下结构重构,与Cub发生互作
膜蛋白酵母双杂交-Dualsystems split ubiquitin原理是:
Cub与LexA-VP16转录激活因子连接成Cub-LexA-VP16,当bait-Cub-LexA-VP16与prey-NubG可互作时,Cub与NubG在空间上接近发生重构,被泛素特异性蛋白酶UBPs识别,LexA-VP16被解离进入核内,使启动子下游基因(抗性筛选、蓝白斑筛选、营养缺陷型筛选等)得到转录。
膜体系酵母双杂选择载体是根据诱饵蛋白质定位的不同来选择,有利于互作蛋白相连的泛素NubG和Cub-LexA-VP16相互作用,被UBPs识别,从而启动下游报告基因表达。主要分为以下几种情况:
1. 若诱饵蛋白的N端在胞质,C端在细胞器腔内(或者胞外),建议用pBT3-N载体构建诱饵。
2. 若诱饵蛋白是C端位于胞质,N端位于细胞器腔内(或者胞外),且N端含有信号肽,选择载体pBT3-SUC构建诱饵重组质粒,这是因为某些哺乳动物细胞的信号肽在酵母中无法识别,而pBT3-SUC中含有一段酵素转化酶(SUC2)基因序列,当其定位在诱饵蛋白N端,能够确保诱饵蛋白正确定位到酵母细胞膜上。
图片来源于DUAL membrane pairwise interaction kit user manual
从载体的图谱上中可以看出,cDNA插入位点(sifI位点)的上游是SUC2,下游是Cub-LexA-VP16。这样表达后诱饵蛋白N端就含有SUC, C端含有Cub-LexA-VP16,诱饵蛋白就能够定位在膜上,并且和互作蛋白的NubG相互作用。
3. 若诱饵蛋白是C端在胞质,N端在细胞器腔内(或者胞外),且N端不含信号肽,推荐使用pBT3-STE。
4. 如果你的诱饵蛋白N端C端均位于胞质,则pBT3-N和pBT3-STE都可以选择。
5. 膜体系的猎物(Prey)载体分别为pPR3-N和pPR3-C。NubG在猎物蛋白N端时建议用pPR3-N。NubG在猎物蛋白C端时采用建议用pPR3-C。
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