如何低成本研究空间转录组？看完这篇文章你或许会有答案

之前小编已经分享了空间转录组中基于原位杂交和原位捕获的技术文章，现在小编给大家分享一篇基于激光显微切割技术的空间转录组文章。华中农业大学余梅团队在International Journal of Molecular Sciences上发表Integrating LCM-BasedSpatio-Temporal Transcriptomics Uncovers Conceptus and Endometrial LuminalEpithelium Communication that Coordinates the Conceptus Attachment in Pigs（IF: 4.56）一文，通过激光捕获显微切割（laser capturemicrodissection，LCM）技术和RNA-Seq，之后使用免疫组化定位关键蛋白，以低成本构建了猪胎体着床的时空间转录图谱，实现了解析猪受孕以及胚胎与子宫内膜腔上皮通讯的研究。

 

 

 

 

背景介绍

 

 

母猪妊娠期为110天到120天，猪是一种多胎动物，在技术上很难在胎体与其周围子宫组织之间建立空间上的一一对应关系。然而胎体和胎体周围的子宫内膜腔上皮之间的同步通信对于着床很重要。激光捕获显微切割 (LCM) 可以从组织中捕获特定的单个细胞或组织，同时保持结构和空间信息。结合LCM和RNA-seq技术，作者在猪的两个关键植入阶段从完整的胎体—子宫内膜界面捕获了胎体及其周围的子宫内膜腔上皮，并构建了胎体—子宫内膜腔上皮界面的时空转录组谱，保留了原生空间信息。然后，作者确定了连接胎体和子宫内膜腔上皮的通讯通路，发现这些通路在胎体着床中具有重要作用。

 

 

 

 

研究结果

 

 

1. 猪胎盘-子宫内膜界面三个空间不同区室的转录组学特征

作者对同一子宫横截面中的三个空间不同的区室进行激光捕获显微切割（图 1）。在低温下将片段切割成13μm厚的切片，经过固定和脱水后进行激光捕获显微切割。这三个区室包括 (1) 与胎体相连的子宫内膜侧的子宫内膜腔上皮（命名为 LE-M），（2）与 LE-M 相邻的胎体和（3）与胎体相对的反子宫内膜侧的子宫内膜腔上皮（命名为作为LE-AM）。将六种类型的样本（每个时间点3个区室）用于 bulk RNA 测序，共检测到 15,062 个基因。其中有已报道在猪子宫内膜腔上皮中表达的基因，例如SPP1（分泌磷蛋白 1）、MUC1（粘蛋白 1）和STC1 (Stanniocalcin 1) ，以及猪受孕表达基因，包括IFNG（干扰素 γ）、PLET1（胎盘表达转录本 1）、PLAC1（胎盘特异性 1）和PLAC8（胎盘特异性 8）。

 

图1实验工作流程示意图

分别从妊娠第12天（gd12，着床前阶段）和第15天（gd15，着床阶段）收集未冲洗出胎盘的猪子宫节段，并使用低温恒温器进行横切。对每个阶段的胎盘-子宫内膜界面的三个空间上不同的隔间进行激光捕获显微解剖 (LCM)，并通过RNA-seq进行分析以生成时空转录组数据。LE-M：子宫内膜侧的子宫内膜腔上皮；LE-AM：反子宫内膜侧的子宫内膜腔上皮；C：胚胎。

 

2. 着床阶段前和着床阶段三个空间不同区室的时间转录变化

在着床之前和着床阶段获得的LE-M和LE-AM中分别检测到1699和1607个基因差异表达。大多数差异表达基因（DEGs）在外泌体方面富集。在LE-M中鉴定的DEG中，与整合素介导的信号通路相关的基因在着床阶段上调。在LE-AM中鉴定的DEG中，参与碳酸脱水酶活性的基因上调，但与细胞表面相关的基因在着床阶段下调。此外，作者在着床阶段之前和着床阶段在胚胎中识别了989个DEG，三个不同区域的转录调控在着床之前和着床阶段明显不同。

 

 

图2猪gd12时LE-M和LE-AM之间鉴定的DEG热图和GO分析

( a ) 与gd12上的LE-AM 相比，LE-M 中识别的DEG的热图。（b）从妊娠第 12 天截取的整个猪子宫横截面的示意图。（c）与 gd12上的LE-AM相比，在LE-M中鉴定的上调DEG的GO分析。DEGs：差异表达基因；LE-M：系膜侧的子宫内膜腔上皮；LE-AM：抗中膜侧的子宫内膜腔上皮；gd12：妊娠第 12 天（着床前阶段）。

 

3. 子宫内两个解剖位置上皮的空间转录差异

作者研究了胎体着床的子宫内膜侧 (LE-M) 和胎体不着床的反子宫内膜侧 (LE-AM) 之间的转录变化。总共鉴定了941个空间差异表达基因（DEG），其中在着床前阶段检测到345个，在着床阶段检测到596个。两个阶段LE-M中大部分上调基因主要富集在外泌体中（图2和图3）。此外，在着床阶段之前和着床阶段的 LE-M 中的大多数上调基因分别在顶端质膜和炎症反应中显著富集（图2和图3），而特定于上调基因的术语在着床阶段的LE-AM主要与质膜的组成部分有关（图2和图3）。因此，在着床阶段，子宫内膜腔上皮的分子特征因子宫内的解剖位置而有很大差异。

 

图 3猪gd15时LE-M和LE-AM之间鉴定的DEG的热图和GO分析。

(a)与gd15上的LE-AM相比，LE-M中识别的DEG的热图。（b）从妊娠第15天截取的整个猪子宫横截面的示意图。（c）与LE-AM（红色）相比，LE-M中鉴定的上调DEG的GO分析，与LE-AM相比gd15上的LE-M（蓝色）。DEGs：差异表达基因；gd15：妊娠第15天（着床阶段）。

 

4. 在着床阶段连接胚胎和子宫内膜腔上皮的通迅途径

分析揭示了来自胎体和子宫内膜腔上皮的DEG参与的信号通路。这些通路大多与胎体附着有关，包括细胞外空间、SPP1介导的细胞粘附通路（如粘着斑和整合素介导的信号通路）和雌激素代谢和信号通路（如代谢通路和PI3K-Akt信号通路）。

 

5. 子宫内LE中具有空间限制性表达模式的基因与胚胎着床之间的关联

在着床阶段LE-M和LE-AM之间鉴定的DEG中，SULT2A1（磺基转移酶家族2A成员 1）和MEP1B（Meprin A 亚基β）是两个最显著差异表达的基因。SULT2A1在 LE-M中显著高表达；相反，MEP1B在LE-AM中显著高表达。因此，对以下时间的猪子宫横断面样本进行免疫组织化学和免疫荧光检测：（1）发情后第12天和第15天，（2）妊娠后第12天和第15天。在发情后的第12天和第15天，子宫内膜腔上皮中SULT2A1完全阴性，但含有分散的MEP1B阳性信号。同样，在妊娠第12天（着床前阶段），子宫内膜腔上皮对SULT2A1保持阴性，而对 MEP1B 显示分散的阳性信号（图 4）。然而，在妊娠第 15 天（着床期），在LE-M中大量检测到SULT2A1，但在 LE-AM 中完全不存在；相反，MEP1B在LE-M中完全不存在，但在LE-AM中大量表达（图 5）。

SPP1 是一种粘附分子，可以介导胎体与子宫内膜腔上皮的附着。作者检查了两种类型的样本在子宫横截面中SPP1的表达模式（图 5）。结果表明，无论胎体位于何处，仅在靠近胎体的子宫内膜腔上皮中观察到 SPP1（图 5）。研究结果表明，在猪子宫的不同区域可能发生胎盘粘附。此外，分别在两种样品上研究了SULT2A1和MEP1B的表达模式。SULT2A1显示出与SPP1完全相同的模式，无论胎体位于何处，SULT2A1都大量存在于靠近胎体的子宫内膜腔上皮中，但在远离胎体的子宫内膜腔上皮中完全不存在。因此，SULT2A1和MEP1B分别在两个不同的胎儿着床和不着床的解剖子宫区域都有极高的表达。

 

 

图 4.SULT2A1和MEP1B在猪子宫内膜腔上皮中的空间表达模式。

( A ) SULT2A1 在猪的整个子宫横截面中的免疫组织化学分析（n = 3 头后备母猪/发情周期日或妊娠日）。( B ) 猪整个子宫横截面中 MEP1B 的免疫荧光分析（n = 3 头后备母猪/发情周期日或妊娠日）。在发情周期第 12 天（a、e）、发情后第 15 天（b、f）、妊娠第 12 天（c、g）和妊娠第 15 天（d , h )，分别。SULT2A1 定位于子宫 M 侧和 AM 侧的子宫内膜区域的高倍放大图像，分别取自发情周期第 12 天 ( a1 , a2 )、发情周期第 15天的相同子宫横截面( b1 , b2 )、妊娠第 12 天 ( c1 , c2 ) 和妊娠第 15 天 ( d1 , d2 )。分别从子宫的 M 侧和 AM 侧显示了MEP1B 在子宫内膜区域的定位的更高放大倍数图像，并且在发情周期第 12 天取自相同的子宫横截面（e1, e2 )、发情周期第 15 天 ( f1 , f2 )、妊娠第 12 天 ( g1 , g2 ) 和妊娠第 15 天 ( h1 , h2 )。比例尺 = 50 µm。

 

 

图 5 SPP1、SULT2A1 和 MEP1B 在两种类型的猪子宫样本中的子宫内膜腔

上皮中的表达，根据妊娠第 15 天在子宫中的胎体定位定义。

（A）取自子宫横截面的代表性图像，其中胎体位于系膜侧（n = 3 头后备母猪）。（B，C）从子宫横断面拍摄的代表性图像。（a - c) 苏木精和伊红染色的整个子宫横截面。从相同的子宫横截面拍摄更高放大倍数的图像，显示 3 种蛋白质从 M 侧定位于子宫内膜区域（SPP1 为（ a11，b11，c11 ）；SULT2A1 为（ a21，b21，c21）；（a31 , b31 , c31 ) 对于 MEP1B)，在 M 和 AM 侧之间 (( a12 , b12 , c12 ) 对于 SPP1; ( a22 , b22, c22 ) 对于 SULT2A1; ( a32 , b32 ,c32) 用于 MEP1B) 和 AM 侧 (( a13 , b13 , c13 ) 用于 SPP1；( a23 , b23 , c23 ) 用于SULT2A1；( a33 , b33 , c33 )用于 MEP1B)。LE：管腔上皮；M侧：内膜侧；AM 侧：反内膜侧。比例尺 = 50 µm。

 

 

 

 

总结

 

 

胎体和胎体周围的子宫内膜腔上皮之间的同步通信对于胎体着床很重要。结合 LCM 和 RNA-seq 技术，作者在猪的着床两个关键时间从完整的胎体与子宫内膜界面捕获了胎体及其周围的子宫内膜腔上皮，并构建了胎体—子宫内膜腔上皮界面的时空转录组谱，保留了原本空间信息。在着床前后以及三个空间区域都鉴定到大量表达差异基因，并通过免疫组化实验鉴定SULT2A1、MEP1B和SPP1基因空间表达差异，发现了连接胎体和子宫内膜腔上皮的通讯通路，以及这些通路在胎体着床时的重要作用。本研究成本较低，或许可以给研究者提供不同的空间转录组学研究思路。

 

 

 

 

参考文献

 

 

Wang F, Zhao S,Deng D, Wang W, Xu X, Liu X, Zhao S, Yu M. Integrating LCM-BasedSpatio-Temporal Transcriptomics Uncovers Conceptus and Endometrial LuminalEpithelium Communication that Coordinates the Conceptus Attachment inPigs. International Journal of Molecular Sciences. 2021; 22(3):1248.