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RNA pull down—研究RNA与蛋白互作的法宝

信息来源：金开瑞作者：genecreate 发布时间：2018-05-10 14:35:15

RNA与蛋白质的相互作用是细胞生理过程得以实现的决定性因素之一。近年来，随着技术的改进和新方法的建立，RNA和蛋白质的相互作用研究取得了长足进步。目前科研人员已经鉴定了较多RNA上的蛋白质结合位点，也发现了许多蛋白质中的RNA结合结构域，并对它们的结构特征进行了比较详细的研究。这些为最终探明RNA和蛋白质相互作用的分子机制，从而从本质上认识相关的细胞生理过程打下了坚实的基础。

RNA pull-down作为研究RNA与蛋白互作的核心技术，已成为研究焦点。RNA pull down是使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过WB实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用，或者结合MS筛选RNA结合的未知蛋白。

RNA pull down技术应用

1.癌症肿瘤相关调控机制研究

LncRNA发挥功能的方式很广，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控。主要包括基因组表观遗传修饰、调控转录后翻译、发挥ceRNA、增强子RNA作用等，从而对细胞的增殖、分化、迁移、凋亡、免疫等发挥调控作用。

lncRNA能够通过对肿瘤细胞糖代谢、谷氨酰胺代谢和脂类代谢途径中的关键环节进行调节，导致肿瘤细胞对葡萄糖摄取增加、谷氨酰胺分解增强及脂质生成增加，从而促进肿瘤的发生和发展。目前，大多数lncRNA在肿瘤细胞能量代谢中的功能和调控机制尚不完全清楚，进一步认识和了解肿瘤细胞中与lncRNA相关的能量代谢异常表现出的恶性生物学行为，将有助于为肿瘤的诊断和治疗提供有效的证据及新的思路和途径。

环状RNA（circular RNA，circRNA）是近来研究很热门的一种特殊的长链非编码RNA。研究发现，circRNA 在人体细胞中广泛表达，在转录后水平具有调控基因表达的重要功能，并且参与多种肿瘤和其他疾病的病理发展过程

circRNA大多由外显子序列组成，呈闭合环状结构，性质稳定，高度保守性，通过微小RNA“海绵”作用调控靶基因表达，与肿瘤的发生、发展相关。这些特性使circRNA有潜力成为肿瘤新型分子诊断标志物。通过竞争性与肿瘤相关微小RNA的结合，可以开发针对circRNA分子靶点的靶向治疗药。因此,circRNA在肿瘤转化医学研究中意义巨大。

2.多种人类疾病研究

RBPs在转录后水平参与调控mRNA稳定性、LncRNA活性、应激、肿瘤发生发展、细胞凋亡等众多生物学过程，且与诸多人类疾病密切相关。因此，对RBPs-RNAs相互作用网络的研究和鉴定有重要意义。但由于RBPs作用方式复杂、功能多样性、作用空间位置多样化等原因，对其开展精确研究一直是一个重大挑战。RNA领域，尤其是非编码RNA研究的快速发展，催生了多种RBPs-RNAs相互作用鉴定技术。

问题	原因	解决方案
RNA结合蛋白的亲和力不够	1）结合缓冲环境没有优化 2）裂解不完全 3）磁珠用量不足 4）RNA探针用量不足	1）优化孵育时间、温度、盐浓度等条件 2）增加裂解液和蛋白上样量的比例 3）增加裂解液 4）增加磁珠或探针用量 5）确定生物素和链霉亲和素效率
RNA结合蛋白没有结合	1）靶蛋白量不足 2）缓冲体系不对 3）RNA探针和蛋白的亲和力本来就低	1）增加上样蛋白量 2）应用低盐体系 3）加入交联试剂
WB信噪比高	1）阳性信号率低 2）一抗效率低 3）蛋白没有充分溶解	1）增加二抗的量 2）用敏感度的化学发光液 3）用细胞裂解液预孵一抗 4）增加样品的量 5）确定有没有其他可能的结合情况 6）增加裂解液用量
结合的非特异性高	1）缓冲环境没有优化 2）缓冲环境严谨性低 3）样品没有裂解完全和裂解体系没有优化	1）优化孵育时间温度盐浓度等条件 2）使用严谨性高的缓冲体系 3）调低RNA探针和样品的比例 4）提高裂解液的量

案例展示

案例一

题目：The STAT3-Binding Long Noncoding RNA lnc-DC Controls Human Dendritic Cell Differentiation

小结：RNA pull-down设置实验组及反义链对照组，银染找出差异条带进行胶条质谱鉴定，分析结果筛选得到STAT3蛋白，进一步通过RIP-qPCR反向验证，证实STAT3蛋白可以与lnc-DC结合。

Lnc-DC pull-down银染检测及RIP验证Lnc-DC与STAT3互作

案例二

题目：The long noncoding RNA THRIL regulates TNFα expression through its interaction with hnRNPL

小结：先用Linc1992全长进行RNA pull-down实验，通过WB检测手段分析四个意向蛋白中筛选得到一个差异蛋白α-hnRNPL，通过分段RNA pull-down及WB分析核心结合区域，主要是Linc1992的1-699和1406-2012区域，通过RIP-qPCR反向验证，证明α-hnRNPL蛋白可以与Linc1992结合。

Linc1992 pull down-WB筛选差异蛋白同时结合RIP验证Linc1992与α-hnRNPL互作

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