如何设计荧光定量PCR的引物及TaqMan探针

        对于做分子实验的人来说，探针引物，一个很熟悉的词语，科研人员也会经常用到，但是对于探针引物的设计，您知道多少？今天，我们就简单的谈下这种引物的设计。

通用原则

1. 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近于探针；

2. 扩增子的长度应不超过400bp，理想的最好能在100－150bp内，扩增片断越短，有效的扩增反应就越容易获得，较短的扩增片断也容易保证分析的一致性；

3. 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，及在SG分析中非特异信号；

4. 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）；

5. 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。

 

探针设计指导

1. 在设计引物之前设计探针；

2. 探针的Tm值应在68－70℃之间，如果是目测探针，则要仔细审查GC富含区；

3. 探针的5’端要避免有鸟氨酸，5’G会有淬灭作用，即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在；

4. 选择C多于G的链作探针，G的含量多于C会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。

5. 探针应尽可能的短，不要超过30个bp。

6. 检测探针的DNA折叠和二级结构。

 

引物设计指导

1. 引物的Tm值应在58－60℃之间，这非常重要，因为我们的试验一般都使用退火温度为60℃，在这个温度下，5’核酸外切酶的活性最高。

2. 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

3. 将引物尽量接近于探针

 

循环参数

当引物和探针按照上述原则设计好后，循环的参数也就确定了，当经过起始的变性温度后(根据Tag酶要求设定)，反应要经过95℃，15－20秒，60℃，60秒，对于一些模板，45秒也足够了，数据在退火时检测。

 

优化探针和引物的浓度

        对于双探针反应，通过选择探针和引物的浓度来优化反应结果，能获得最低的CT值，以及相对于背景来说荧光值有最高的增长。引物浓度应该在50nM-900nM 范围内进行优化，探针浓度应该在50－250nM范围内优。探针的浓度应该从（50，100，250nM）与引物浓度相组合，在Rotor-Gene上进行试验，选择最小CT值和最高反应扩增的曲线做后续试验。

        通常所用的探针和引物浓度分别为250nM 和900nM，绝大多数反应都可以在这个浓度下进行，但为了寻找最佳的浓度，还是应该依照上述的步骤。由于引物溶解温度预测的差异和多种探针设计程序，因此使用三种退火温度（58℃，60℃，62℃）对优化是很有用的。引物的浓度也会影响溶解温度，高的引物浓度会让溶解温度提高2度左右。Primer3是个非常有用的软件，但它不能避免3‘端的G，所以应将3’端的G去除，并观察探针的退火温度是否比引物高8－10度。

 

定量数据的分析

分析定量数据主要有两种基本的方法：绝对定量和相对定量。研究人员应该根据扩增子和试验目的来决定如何分析定量数据。

 

（1）绝对定量

        绝对定量是将未知样品与标准曲线相比较进行分析，一般标准品就是一个已知绝对浓度的DNA样品，关于何种标准品用于标准曲线一直有很多讨论，理想的标准品其扩增方式应该是与待测样品一致得，然而这往往是不可能的。一些人会克隆他们得目的基因，并与未知样品比较。要注意得是，绝对定量分析的准确性是依靠标准品的准确性得。

        在Rotro-Gene 上可以用几种方法来分析绝对定量数据。包括标准曲线在内的R值，反应效率都会被呈现出来。也可以从以外的分析中调用标准曲线并让它与一个标准品相调整，（或重复相同的标准品），这个功能在确定斜率的重复性好与Y截距的基础上完成。对一个标准曲线来说，一个单独的标准品就已经足够了，也可以在不同的通道甚至一个通道内绘制多条标准曲线。

 

（2）相对定量

        相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较，其结果是一个比率，没有确切的数字被检测道。一种检测基因表达相对定量的方法叫“比较CT值法（⊿⊿Ct）”，这种方法可以彻底不需要标准曲线，通过观察与一个动态相关对照比较的表达水平，从而可以将模板与增加的样品间进行相对定量。要使这种方法成功，目的及参照的动态范围应该相类似。相对的一个敏感的方法就是看⊿Ct（相同的起始模板浓度，两个扩增子的两个CT值的差异）随着不同稀释度的模板有什么变化。如果两个扩增子的反应效率大致相同，则the plot of log input amount versus ⊿Ct 将是一条水平线（斜率<0.01）。这意味着在初始模板浓度范围内，两个扩增子有相同的反应效率。如果检测发现效率不一致，则应该用标准曲线来对基因表达进行定量，或优化反应获得一个类似的效率。