RNA pulldown
- RNA结合蛋白质
- 高灵敏度
- 高度特异性
- 可定量分析
服务特色
金开瑞现提供RNA pull down检测技术服务，使用特异性二抗进行检测，能有效避免抗体重链对结果的信号干扰。并且金开瑞配套自己的质谱平台，能显著提升检测效果。
服务介绍
蛋白质与RNA的相互作用是许多细胞功能的核心，如蛋白质合成、mRNA组装、病毒复制、细胞发育调控等。使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过WB实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。若待检测目的蛋白明确，选择WB鉴定；若不明确，则可选择质谱鉴定。
服务优势
- 高特异性：富集与特定RNA序列相互作用的蛋白质，具有高度的特异性
- 高灵敏度：能够检测低丰度的RNA结合蛋白质，提供高灵敏度的检测能力
- 广泛适用性：可用于研究各种RNA结合蛋白质，包括转录因子、RNA结合蛋白和翻译调控因子等
- 可定量分析：通过引入外源标记或荧光标记的RNA探针，可以定量测量RNA与蛋白质的结合强度
- 联合应用：可与其他技术相结合，如质谱分析、蛋白质组学方法和转录组学方法等，进一步深入研究RNA-蛋白质相互作用的功能和调控网络
服务流程
客户提供
RNA序列或者RNA序列构建的质粒（种属）
相同种属的细胞样品
最终交付
- 基因合成测序报告；
- 构建含目的基因的质粒、菌液，测序报告；
- 体外转录模版的sense&antisense引物、模版电泳图；
- RNA Pull down蛋白SDS-PAGE银染；
- 质谱鉴定报告。
服务说明
| 服务名称 | 服务内容 | 交付内容及标准 | 服务周期(工作日) |
| RNA pull-down （体外转录法） |
基因合成 |
测序报告 | 具体评估 |
| 体外转录sense和antisense模板扩增 | 体外转录2次 | 20 | |
| sense和antisense体外转录并标记为探针 | 探针标记2次(sense、antisense各1次) | ||
| RNA pull-down富集 | 2次 | ||
| SDS-PAGE银染 | 跑胶3个泳道 | 4 | |
| 质谱鉴定互作蛋白 | 质谱鉴定sense、antisense | 10-15 | |
| RNA pull-down （探针法拉蛋白） |
QPCR检测本 底表达 探针设计及合成 (包含对照) |
样本和内参各1次 circRNA探针-biotin/lncRNA探针-biotin/普通对照探针 |
24 |
| RNA探针富集效果检测 | 实验探针和对照探针各1次 | ||
| RNA pull-down富集 | 实验探针和对照探针各1次 | ||
| SDS-PAGE银染 | 跑胶3个泳道 | 4 | |
| 质谱鉴定互作蛋白 | 质谱鉴定对照组和实验组各1次 | 10-15 | |
| RNA pull-down (探针法拉miRNA) |
QPCR检测本 |
样本和内参各1次 | 28 |
| 底表达 | |||
| 探针设计及合成 | circRNA探针-biotin/lncRNA探针-biotin/对照探针 | ||
| RNA探针富集效果检测 | 实验探针和对照探针各1次 | ||
| RNA pull-down富集 互作的蛋白/miRNA | 实验探针和对照探针各1次 | ||
| RNA和miRNA/lncRNA 逆转录及检测 | QPCR检测(input、探针组、对照组) |
案例展示
常见问题与解析 (Q&A)
RNA pull down使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。 蛋白质与RNA的相互作用是许多细胞功能的核心，如蛋白质合成、mRNA组装、病毒复制、细胞发育调控等。若待检测目的蛋白明确，选择Western blot鉴定；若不明确，则可选择质谱鉴定。
LncRNA的富集大致上有三种方法: (1)探针法：针对该LncRNA的序列，设计生物素标记的探针。此种方法最关键的是探针的特异性，所以最好用Northern Blot检测探针的特异性。 可以结合内源的LncRNA是探针法的最大优势。缺点就是比较贵，需要的样品量大。 (2)生物素标记法：在LncRNA的5‘端加上T7启动子，利用体外转录试剂盒，可以制备大量的LncRNA。再通过生物素标记试剂盒，就能得到大量的生物素标记的LncRNA。常用的折叠的方法退火，从95℃退火到4℃，大约30秒一度就可以了。 (3)TRSA法：除了生物素，链霉亲和素还可以识别TRSA结构，因此在LncRNA的一端加上TRSA序列也是不错的选择。
可以，前提是circRNA在细胞中表达丰度要高。
有，探针法和生物素标记法的对照都是相应的反义序列：探针的反义序列以及长非编码RNA的反义序列。TRSA法的对照是TRSA序列本身。
相关资源
1、RNA pull-down的实验步骤
● 设计和合成RNA探针：根据目标RNA序列的特定区域设计和合成RNA探针，通常使用化学修饰或放射性标记来标记RNA探针。
● 准备RNA结合反应体系：将RNA探针与细胞提取物、组织提取物或体外合成的蛋白质混合，形成RNA-蛋白质复合物的反应体系。可以添加适当的缓冲液和辅助物质来维持反应条件和增加特异性。
● 进行RNA pulldown：将RNA探针与固相材料（如琼脂糖珠子或磁珠）结合，通过亲和吸附的方式富集目标RNA-蛋白质复合物。可以使用离心管、微量管或固相提取柱等不同形式的富集材料。
● 洗涤和纯化：对富集的RNA-蛋白质复合物进行洗涤，以去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。可以使用适当的洗涤缓冲液来实现选择性的洗涤步骤。
● 蛋白质鉴定和分析：对富集的RNA-蛋白质复合物进行蛋白质鉴定和分析，常用的方法包括质谱分析（如质谱鉴定或定量蛋白质组学），Western blotting等。这些分析方法可以帮助鉴定和定量与目标RNA相互作用的蛋白质。
2、RNA pull-down应用场景
● 鉴定RNA结合蛋白质：用于筛选和鉴定与特定RNA序列结合的蛋白质，揭示RNA的结合伴侣和调控网络。
● 研究RNA结合蛋白质的功能：通过RNA pull-down实验，可以评估RNA结合蛋白质的功能，包括转录调控、RNA稳定性和翻译调控等。
● 研究RNA修饰修饰酶：可以用于鉴定与特定RNA修饰酶相互作用的蛋白质，了解RNA修饰的机制和调控。
● 探索RNA与疾病相关蛋白质的相互作用：通过RNA pull-down实验，可以揭示RNA与疾病相关蛋白质的相互作用，并深入了解其在疾病发生和进展中的作用。
3、研究RNA-蛋白质相互作用的几种常用技术简介、优势和适用范围
| 技术 |
简介 |
优势 | 适用范围 |
| RNA pull-down |
RNA pull-down技术用于研究RNA与与其相互作用的蛋白质之间的相互作用。该技术利用RNA的特异性结合能力，通过将RNA靶点固定在固相支持上，然后与细胞提取物或纯化的蛋白质混合，通过共沉淀实验检测RNA-蛋白质的相互作用。 |
- 可以直接检测RNA与蛋白质之间的相互作用。 | - 研究RNA与蛋白质之间的相互作用。 |
| - 可以筛选和鉴定与特定RNA相互作用的蛋白质。 | - 揭示RNA在基因调控和细胞功能中的作用。 | ||
| - 可以揭示RNA在基因调控和细胞功能中的作用。 | - 研究RNA参与的信号通路和疾病机制。 | ||
|
- 可以与其他技术相结合，如质谱分析和转录组学方法，进一步研究RNA-蛋白质相互作用的功能和调控网络。 |
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| CLIP-seq |
CLIP-seq技术（Cross-linking and immunoprecipitation followedby high-throughput sequencing）用于鉴定RNA与与其相互作用的蛋白质之间的结合位点。该技术结合了RNA与蛋白质的共价交联和免疫共沉淀，通过高通量测序分析交联后的RNA和结合蛋白质，鉴定它们的相互作用位点。 |
- 可以鉴定RNA与特定蛋白质之间的结合位点。 | - 鉴定RNA与蛋白质之间的结合位点和相互作用模式。 |
| - 可以全基因组范围内分析RNA-蛋白质相互作用的模式和特征。 | - 揭示RNA参与的调控网络和疾病机制。 | ||
| - 可以揭示RNA参与的调控网络和疾病机制。 | - 研究RNA参与的信号传导和细胞功能。 | ||
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- 可以提供高分辨率的RNA-蛋白质相互作用图谱。 |
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| RNAi |
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种通过引入特定的小分子RNA（siRNA或shRNA）来抑制特定基因表达的技术。该技术可以靶向特定的RNA序列，并降低或抑制目标基因的表达。 |
- 可以高度特异性地抑制目标基因的表达。 | - 研究基因功能和基因调控。 |
| - 可以进行基因功能研究、基因沉默和表达调控的实验。 | - 高通量筛选和功能验证。 | ||
| - 可以在细胞和整个生物体中进行基因敲除或敲下实验。 | - 研究信号传导和疾病机制。 | ||
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- 可以研究基因调控、信号通路和疾病发生机制。 |
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| RIP |
RIP（RNA Immunoprecipitation）技术用于研究RNA与与其相互作用的蛋白质之间的相互作用。该技术通过使用抗体特异性地免疫共沉淀RNA与其结合的蛋白质，从而鉴定和分析RNA-蛋白质复合物。 |
- 可以鉴定RNA与特定蛋白质之间的相互作用。 | - 研究RNA与蛋白质之间的相互作用。 |
| - 可以研究RNA参与的转录调控、翻译调控和RNA稳定性等过程。 | - 揭示RNA参与的转录调控和翻译调控过程。 | ||
| - 可以揭示RNA-蛋白质相互作用在细胞功能和疾病发生中的作用。 | - 研究RNA-蛋白质相互作用在细胞功能和疾病发生中的作用。 | ||
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- 可以与高通量测序等技术相结合，获得全基因组范围内的RNA-蛋白质相互作用图谱。 |
