his pull down实验原理如何洗脱蛋白？

    His pull-down实验是一种常用的蛋白互作分析方法，基于组合特定亲和标签（如His-tag）的表达蛋白和配体蛋白进行特异性结合，再通过洗涤获得结合复合物，最后通过洗脱蛋白的方式获取单个或多个结合蛋白的纯化物。以下是His pull-down实验中常用的蛋白洗脱方法：

一、Histidine竞争洗脱法

    在His pull-down实验的最初步骤中，使用组合有His标签的表达蛋白和其配体蛋白来进行特异性结合。随后进行洗涤步骤，利用组合纯化蛋白的特异性结合，并将非特异性结合物的去除。接下来使用Histidine竞争洗脱法去除结合至His标签表达蛋白上的目标蛋白质。这种方法的优点是简单易行，可高效的得到结合蛋白的纯化物。具体实施方法如下：

    1、在特异性结合和洗涤步骤完成后，加入含不同浓度的释放剂（通常为组氨酸，可以替代His标签与该复合物的结合），与其结合，将目标蛋白卸下。

    2、洗涤其余部分，去除单独的竞争剂和结合物。

    3、再用一定方法将目标蛋白进一步还原。其中最常见的方法是利用组合含Histidine的缓冲液来洗脱表达His-tag的蛋白。

二、酸洗法

    酸洗法在His pull-down实验中也被广泛应用。它可以在无需使用特定的竞争剂的情况下，直接提取并还原结合至His标签表达蛋白上的目标蛋白质。酸洗法的优点在于简单、快速、高效，并且获得的结合物不受竞争剂发生的污染影响，成本比较低。具体实施方法如下：

    1、在特异性结合和洗涤步骤完成后，以酸性缓冲液进行Elution（洗脱）。酸性缓冲液中的H+可以还原组成复合物的两个蛋白质间的键合。因此，目标蛋白可以从组合复合物中释放出来。

    2、在Elution过程中，要保证pH值和离子强度的平衡，使得目标蛋白的稳定性保持不变。

    3、Elution液可以被经过再生后重复使用。

三、尿素洗脱法

    尿素洗脱法是一种常用的洗脱方法。本质上就是使用尿素等还原剂，破坏复合物中的非共价相互作用，使目标蛋白从复合物中分离出来。具体实施方法如下：

    1、在特异性结合和洗涤步骤完成后，加入含有一定浓度的尿素的缓冲液。

    2、对于组成复合物的两个蛋白质之间的氢键、范德华力等非共价相互作用中断后，目标蛋白从复合物中分离出来。

    3、通过洗脱的方法，将目标蛋白提取出来。

    以上是His pull-down实验中常用的蛋白洗脱方法，每种方法都具有其特殊的优点和注意事项。在实际应用中，要根据实验条件和需要进行选择。