双荧光素酶报告系统原理和步骤
双荧光素酶报告系统是一种常用于酵母双杂交实验的报告系统,用于检测融合蛋白质相互作用的活性。它基于荧光素酶(Firefly luciferase)和海洋甲壳动物的荧光素酶(Renilla luciferase),通过测量其荧光素酶活性的变化来指示蛋白质相互作用的程度。
以下是双荧光素酶报告系统的基本步骤和原理:
1、构建融合蛋白质编码序列:
选择目标蛋白质A和B,并将其编码序列与DNA结合域(DBD)或激活域(AD)融合,构建DBD-A或AD-B融合蛋白质的表达载体。
转化酵母菌株:
将DBD-A和AD-B表达载体分别转化到两个不同的酵母菌株中,确保每个菌株都带有相应的选择标记。
筛选与培养:
在选择性培养基上培养转化后的酵母菌株,筛选出含有且只含有DBD-A和AD-B的菌株。
2、检测荧光素酶活性:
收集含有DBD-A和AD-B的酵母菌株,裂解细胞并提取蛋白质。
分别加入荧光素酶底物(luciferin)和共反应底物(co-substrate)两个底物,激发荧光素酶的活性。
荧光素酶底物与荧光素酶反应产生发光,Renilla荧光素酶底物与Renilla荧光素酶反应产生另一种发光。
使用荧光素酶报告系统的检测设备(比如荧光素酶检测仪)测定发光强度。
3、分析结果:
通过测量荧光素酶和Renilla荧光素酶的发光强度来评估蛋白质A和B之间的相互作用程度。
荧光素酶和Renilla荧光素酶的发光强度比值可用作相互作用的指标,较高的比值表示相互作用较强。
双荧光素酶报告系统能够提供较为灵敏和可靠的结果,用于定量评估蛋白质相互作用的强度。在使用该系统时,需要注意选择合适的对照组和阳性对照,以确保实验结果的准确性和可靠性。