gst蛋白纯化步骤原理

信息来源:金开瑞 作者:genecreate 发布时间:2023-08-15 14:41:00

    GST蛋白纯化是一种常用的蛋白质纯化技术,通过利用谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase,GST)标签来纯化目标蛋白。下面是GST蛋白纯化的一般步骤和原理:

    构建GST标签融合表达载体:将GST基因的编码序列与目标蛋白的编码序列融合,构建GST-目标蛋白融合表达载体。这样,在细胞中表达该融合蛋白时,GST标签会紧密结合在目标蛋白的C端或N端。

    转染和蛋白表达:将构建好的GST-目标蛋白融合表达载体转染到合适的宿主细胞(如大肠杆菌),使其产生大量的融合蛋白。

    细胞裂解和融合蛋白的亲和层析:收获融合蛋白的细胞,通过细胞裂解等方法破坏细胞膜,释放融合蛋白。然后,将溶解的细胞提取物加载到含有谷胱甘肽固定在琼脂糖(或其他载体)上的亲和层析柱中。GST标签可以特异性地与琼脂糖上的谷胱甘肽结合。

    洗脱:通过洗脱缓冲液来去除非特异性结合的蛋白质,保留GST-目标蛋白复合物。洗脱通常使用还原剂(如谷胱甘肽)、低pH或其他方式进行。

    目标蛋白的解离:将GST标签从目标蛋白上解离,得到纯化的目标蛋白。这可以通过特定的酶切位点(如蛋白酶TEV切割位点)和相应的酶进行酶切,使GST和目标蛋白分别释放。

    纯化分析:对纯化的目标蛋白进行分析,如SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot等方法,确认目标蛋白的纯度和完整性。

    GST蛋白纯化技术的原理是基于GST标签的亲和层析纯化。GST标签可与谷胱甘肽结合,该结合是高特异性的。通过利用谷胱甘肽固定在亲和层析柱上,可以将GST标签蛋白及其结合的目标蛋白从细胞提取物中分离出来。随后,通过解离GST标签和目标蛋白的复合物,可以得到纯化的目标蛋白。

    在进行GST蛋白纯化时,对于融合表达载体的设计和构建、宿主细胞的选择、裂解条件和亲和层析条件的优化等方面都需要合理考虑,以获得高质量的纯化目标蛋白。

 


 




X