实时荧光定量PCR技术原理
实时荧光定量PCR(Polymerase Chain Reaction)技术是一种用于测量PCR反应过程中产生的DNA数量的方法,其原理如下:
反应体系准备:将待检测样品中的DNA与引物(特异性序列)和荧光探针(含有一个荧光团和一个阻尼剂)加入到PCR反应管中。
PCR扩增:通过循环加热和降温的方式,使DNA在酶的作用下进行多轮扩增。每一轮循环包括三个步骤:变性、退火和延伸。在变性过程中,双链DNA解旋成两条单链模板。在退火过程中,引物结合到目标序列上。在延伸过程中,DNA聚合酶沿着引物扩增模板序列,合成新的DNA链。
荧光信号检测:在PCR反应中,荧光探针结合到目标序列的靶标区域上,并被DNA聚合酶所识别。当DNA聚合酶在延伸过程中遇到荧光探针时,它将切断探针上的阻尼剂,释放出荧光团。荧光信号的强度与PCR反应中目标序列的初始数量成正比。
实时监测:在PCR反应过程中,使用特定的仪器(如实时荧光PCR仪)对荧光信号进行实时监测,并记录下每一轮扩增后的荧光强度。通过监测荧光信号的变化,可以确定PCR反应的指数阶段和平台阶段。
数据分析:根据实时监测到的荧光信号曲线,可以通过计算相对荧光单位(RFU)或循环阈值数(Ct值)来定量检测样品中目标DNA的起始数量。Ct值越低,表示起始DNA数量越多。
实时荧光定量PCR技术可用于定量分析基因表达水平、检测病原体、进行基因拷贝数分析等多个应用领域。
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