细胞免疫荧光实验步骤及注意事项

一、细胞免疫荧光实验步骤

    1、细胞准备：取出生长状态良好的细胞，弃培养基，消化重悬细胞，接种于培养皿中，培养至适宜密度。

    2、固定：去除培养基，加入4%多聚甲醛固定液，室温固定20分钟或4℃固定15分钟。

    3、通透：去除固定液，用PBS洗涤，加入0.2% Triton X-100通透细胞，室温孵育10分钟（膜蛋白忽略）。

    4、封闭：用5% BSA封闭样本，37℃孵育30分钟。

    5、一抗孵育：去除封闭液，加入一抗工作液，4℃孵育过夜。

    6、二抗孵育：去除一抗，加入荧光二抗工作液，室温避光孵育1小时。

    7、染核：去除二抗，加入DAPI工作液，避光室温孵育10分钟。

    8、封片：去除DAPI，用抗荧光衰减封片剂封片，直接在荧光显微镜下观察并采集图像。

二、注意事项

    1、在操作过程中应轻柔处理细胞，避免细胞损伤。

    2、固定和通透步骤要根据实验需求和细胞类型适当调整。

    3、封闭步骤是为了减少非特异性结合，提高实验的特异性。

    4、一抗和二抗的孵育时间和温度应根据抗体说明书和实验设计进行优化。

    5、在荧光显微镜下观察时，应尽量缩短时间以减少荧光淬灭。

    6 、实验中应设置适当的阴性对照，以排除非特异性信号。

    7、使用新鲜的固定液和封闭液，以降低背景信号。

    8、所有操作应在适当的条件下进行，如避光孵育等。