原核表达载体构建和真核的区别是什么？
一、定义和宿主细胞类型
1、原核表达载体构建：
原核表达载体是用于在原核生物（如大肠杆菌）中表达外源基因的载体。原核生物是单细胞生物，没有细胞核和复杂的内膜系统。例如，大肠杆菌是最常用的原核表达宿主，它繁殖速度快，易于培养，成本较低。
2、真核表达载体构建：
真核表达载体是用于在真核细胞（如酵母、哺乳动物细胞等）中表达外源基因的载体。真核细胞有细胞核、细胞器等复杂的细胞结构。例如，在生物技术中常用的酿酒酵母是一种真核生物，哺乳动物细胞系如 HEK293 细胞也被广泛用于真核蛋白的表达，因为它们能够对蛋白质进行许多真核生物特有的修饰。
二、载体结构特点
1、原核表达载体：
具有原核生物的复制起始位点（ori），能够在原核细胞中自主复制。例如，pUC 系列载体的复制起始位点来自于 pMB1 质粒，使得载体可以在大肠杆菌中大量复制。
含有多克隆位点（MCS），方便插入外源基因。MCS 通常包含多种限制性内切酶的识别位点，便于选择合适的酶来切割载体和目的基因，然后进行连接。
一般有选择标记基因，如抗生素抗性基因（如氨苄青霉素抗性基因）。在含有相应抗生素的培养基中培养转化后的细菌，只有含有载体的细菌才能生长，从而筛选出成功转化的细胞。
有些原核表达载体还带有启动子和终止子序列，启动子能引导 RNA 聚合酶结合并启动转录，如乳糖操纵子的启动子（lacP）。当诱导物（如 IPTG）存在时，可以启动目的基因的转录。终止子则用于终止转录过程。
2、真核表达载体：
同样具有复制起始位点，但它是适合真核细胞复制的。例如，在酵母表达载体中，其复制起始位点能使载体在酵母细胞中稳定复制。
包含增强子元件，它可以增强基因的转录效率。增强子的作用不受位置和方向的限制，可以在基因的上游、下游或内部发挥作用。
有真核生物的启动子，如 CMV（巨细胞病毒）启动子，在多种真核细胞中都有很强的启动转录能力。还有终止信号和 poly (A) 加尾信号，确保转录后的 mRNA 能够正确加工和稳定存在。
具有真核生物的选择标记基因，例如在哺乳动物细胞表达载体中，常用新霉素抗性基因（neo）作为选择标记。在含有 G418（新霉素类似物）的培养基中，只有成功转入载体的细胞能够存活，从而筛选出阳性克隆。另外，对于一些酵母表达载体，常用的选择标记有营养缺陷型标记，如 URA3 基因，当酵母细胞在缺乏尿嘧啶的培养基中培养时，只有含有该基因的载体转化的细胞才能生长。
三、目的基因表达过程的差异
1、转录过程：
原核表达载体：原核生物的转录和翻译是偶联的，即转录还没结束，翻译就已经开始。原核生物的 RNA 聚合酶直接识别启动子序列，开始转录目的基因，转录出的 mRNA 没有内含子，不需要进行复杂的剪接过程。例如，在大肠杆菌中，当乳糖操纵子的启动子被诱导启动后，RNA 聚合酶就沿着 DNA 模板链转录出相应的 mRNA。
真核表达载体：真核生物的转录发生在细胞核中，需要多种转录因子与启动子结合，招募 RNA 聚合酶 Ⅱ 来启动转录。而且真核基因往往含有内含子，转录后的 mRNA 前体（pre - mRNA）需要经过复杂的剪接过程，去除内含子，将外显子连接起来，才能形成成熟的 mRNA。例如，在哺乳动物细胞中，CMV 启动子结合相应转录因子后启动转录，产生的 pre - mRNA 在细胞核内的剪接体作用下进行剪接。
2、翻译过程：
原核表达载体：原核生物的核糖体可以直接结合到 mRNA 上的核糖体结合位点（RBS，如 SD 序列），起始翻译过程。翻译起始密码子一般是 AUG，编码甲硫氨酸。原核生物的翻译效率较高，因为转录和翻译紧密相连。例如，在大肠杆菌中，核糖体识别 mRNA 上的 SD 序列后，就可以开始合成目的蛋白。
真核表达载体：真核生物的核糖体需要识别 mRNA 的 5' 帽子结构，然后扫描 mRNA 找到起始密码子 AUG 来起始翻译。翻译过程在细胞质中进行，而且真核细胞中翻译后的蛋白质还可能会进入内质网、高尔基体等细胞器进行进一步的修饰和加工。例如，在哺乳动物细胞中，新合成的蛋白质如果带有信号肽，就会被引导进入内质网进行糖基化等修饰。
三、表达产物的特点
1、原核表达载体：
表达的蛋白质通常没有经过复杂的修饰，如糖基化、磷酸化等真核生物特有的修饰。所以对于一些需要这些修饰才能发挥功能的蛋白质，原核表达系统可能不太合适。但是，原核表达系统可以快速、大量地生产蛋白质，例如生产一些酶、抗原蛋白用于研究和工业生产等。
2、真核表达载体：
表达的蛋白质能够进行正确的折叠和复杂的修饰，更接近天然状态下真核生物产生的蛋白质。这对于研究那些功能依赖于修饰的蛋白质（如膜蛋白、分泌蛋白等）是非常重要的。不过，真核表达系统相对复杂，培养成本较高，产量可能比原核表达系统低。
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