GST pulldown蛋白质与蛋白质相互作用实验服务价格

    GST pull down实验服务价格每家公司差异很大。

    GST Pulldown 实验服务是一种用于研究蛋白质与蛋白质相互作用的重要技术手段，以下是相关介绍：

一、原理

    将靶蛋白与谷胱甘肽 S - 转移酶（GST）融合表达，形成 GST 融合蛋白。由于 GST 能特异性地与谷胱甘肽结合，可将 GST 融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，作为 “诱饵蛋白”。当目的蛋白溶液经过时，与 “诱饵蛋白” 相互作用的目的蛋白（即 “捕获蛋白”）会被吸附，而未结合的杂质则随洗脱液流出。最后通过改变洗脱液或洗脱条件，将结合的蛋白复合物洗脱下来，再经 SDS-PAGE 电泳等方法进行分析，从而证实两种蛋白间的相互作用，或筛选相应的目的蛋白.

二、实验步骤

    构建表达载体：将编码靶蛋白的基因片段插入到含有 GST 标签的表达载体中，构建成 GST 融合蛋白表达载体.

    表达与纯化 GST 融合蛋白：将构建好的表达载体转化到合适的宿主细胞中，如大肠杆菌 BL21 等，通过诱导表达使宿主细胞大量合成 GST 融合蛋白。然后利用亲和层析等方法对 GST 融合蛋白进行纯化，得到高纯度的 “诱饵蛋白”.

    准备样品：获取含有目的蛋白的细胞裂解液或纯化的目的蛋白溶液。细胞裂解液可以是从组织细胞中提取的总蛋白，也可以是过表达目的蛋白的细胞裂解产物.

    Pull-down 实验：将纯化的 GST 融合蛋白与样品混合，在适宜的条件下孵育，使 “诱饵蛋白” 与目的蛋白充分结合。之后加入谷胱甘肽亲和树脂，与 GST 融合蛋白结合的目的蛋白会被吸附到树脂上，而未结合的蛋白则留在上清液中。通过离心或过滤等方法收集树脂，并用洗涤液多次洗涤，去除非特异性结合的蛋白.

    洗脱与检测：使用合适的洗脱液将结合在树脂上的蛋白复合物洗脱下来，得到含有相互作用蛋白的样品。接着可通过 SDS-PAGE 电泳、Western Blotting、质谱分析等技术对洗脱下来的蛋白进行检测和鉴定，以确定与 “诱饵蛋白” 相互作用的目的蛋白及其分子量、含量等信息.

三、应用

    验证已知蛋白间的相互作用：对于已经预测或初步认为可能存在相互作用的两个蛋白，可以通过 GST Pulldown 实验进行体外验证，为进一步研究其在生物体内的功能和作用机制提供依据.

    筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白：当研究一个已知蛋白的功能及其相关的信号通路时，可以利用 GST Pulldown 实验从细胞裂解液或蛋白库中筛选出与之相互作用的未知蛋白，有助于发现新的蛋白相互作用网络和潜在的调控因子.

    确定蛋白相互作用的结构域：通过构建不同缺失突变体的 GST 融合蛋白，进行 GST Pulldown 实验，可以确定蛋白之间相互作用所必需的结构域或关键氨基酸残基，为深入理解蛋白相互作用的分子机制提供重要信息.

    研究蛋白复合物的组成：在一些复杂的生物过程中，蛋白质往往以复合物的形式发挥作用。GST Pulldown 实验可以帮助捕获与目标蛋白形成复合物的其他相关蛋白，从而解析蛋白复合物的组成和结构，为研究其生物学功能和调控机制奠定基础.

四、注意事项

    表达载体的选择：要考虑载体表达蛋白量的高低、是否能被诱导剂诱导表达等因素，常用的载体是 pgex-4t-1 等.

    蛋白表达条件的优化：包括诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度等。例如，诱导温度过高可能导致载体形成包涵体，影响蛋白活性，一般建议在 16℃-25℃进行诱导表达.

    样品的处理：细胞裂解要充分，同时要注意防止蛋白降解，可添加蛋白酶抑制剂，并尽量在低温条件下操作.

    亲和树脂的选择与处理：应根据实验需求选择合适的谷胱甘肽亲和树脂，并按照说明书进行正确的预处理和保存，以确保其结合活性和特异性.

    对照实验的设置：至少要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照可使用已知能相互作用的蛋白对来验证实验体系的有效性；阴性对照则可使用仅固定 GST 蛋白而不加目的蛋白的样本，以排除非特异性结合的干扰.

    实验结果的验证：由于 GST Pulldown 实验是在体外进行的，其结果不能完全代表蛋白在生理条件下的真实相互作用情况，因此通常需要结合其他实验方法，如免疫共沉淀（Co-IP）、荧光共振能量转移（FRET）等体内实验技术，对实验结果进行进一步的验证和确认.