常用的DNA探针标记方法有哪些？

常用的 DNA 探针标记方法主要有以下几种：

1、放射性标记法

（1）缺口平移法：利用 DNA 酶 Ⅰ 在双链 DNA 上随机切开若干个单链切口，形成 3′-OH 末端，然后在大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的作用下，以切口处的 3′-OH 为引物，以 dNTP（其中一种带有放射性核素标记，如 α-³²P-dCTP 等）为原料，按照碱基互补配对原则，将带有标记的核苷酸逐个添加到切口的 3′-OH 末端，同时该酶的 5′→3′外切核酸酶活性会从切口的 5′端逐步切除原来的核苷酸，从而使新合成的链带有放射性标记，最终得到均匀标记的 DNA 探针。

（2）随机引物法：先将待标记的 DNA 变性为单链，然后加入人工合成的随机寡核苷酸引物（一般是六聚体），这些引物能与单链 DNA 模板随机互补结合，在 Klenow 片段（DNA 聚合酶 Ⅰ 的大片段，保留了 5′→3′聚合酶活性，但没有 5′→3′外切酶活性）作用下，以 4 种 dNTP（其中一种进行放射性标记）为原料，按照模板链进行互补延伸合成，最终得到标记的 DNA 探针。这种方法标记效率较高，可用于标记各种来源的 DNA。

（3）末端标记法：包括 5′末端标记和 3′末端标记。对于 5′末端标记，例如可以利用 T4 多核苷酸激酶，在有 ATP（其中 γ 位的磷酸带有放射性标记，如 γ-³²P-ATP）存在的条件下，将 DNA 分子 5′端的羟基磷酸化，从而使 DNA 的 5′端带上放射性标记；3′末端标记可通过末端转移酶，以带有放射性标记的 dNTP（如 ³²P-dNTP）为底物，在 DNA 分子的 3′末端逐个添加标记的核苷酸，实现 3′末端标记。此方法适用于标记特定末端的 DNA 片段，常用于分析 DNA 片段的末端结构等情况。

2、非放射性标记法

（1）地高辛标记法：将地高辛配基通过特定的化学连接臂连接到 dUTP 上，形成地高辛 - dUTP。在进行 DNA 探针标记时，例如通过随机引物法等常规的 DNA 合成过程，以地高辛 - dUTP 代替部分 dTTP 掺入到新合成的 DNA 链中，从而使 DNA 探针带有地高辛标记。后续可以用抗地高辛抗体（一般标记有酶等可检测的物质）与之特异性结合，再通过相应的酶促显色反应等进行检测，灵敏度较高，而且安全性好，避免了放射性物质的使用和相关危害。

（2）生物素标记法：把生物素连接到 dUTP 等核苷酸上形成生物素化的核苷酸，在 DNA 合成过程中（如利用切口平移、随机引物等方式），使其掺入到 DNA 链中实现标记。之后利用亲和素或链霉亲和素对生物素的高度特异性亲和结合能力，结合带有可检测标记（如酶标记）的亲和素或链霉亲和素，通过相应的显色反应等进行检测，操作相对简便，也是常用的非放射性标记手段，在分子生物学检测等领域应用广泛。

（3）荧光素标记法：将荧光素基团通过化学修饰连接到核苷酸上，在 DNA 探针合成时，使带有荧光素标记的核苷酸掺入到 DNA 链中，这样的 DNA 探针可以直接在荧光显微镜下观察或者利用荧光检测仪器进行检测，能对特定的 DNA 序列进行定位、定性分析等，并且具有检测快速、背景干扰相对小等优点，常用于原位杂交等多种检测场景。