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4D蛋白质组学：覆盖度更深、重现性更好、采集速度更快！

信息来源：金开瑞作者：genecreate 发布时间：2021-07-21 11:25:48

4D蛋白质组学在传统3D保留时间（retentiontime）、质荷比（m/z）、离子强度（intensity）这三个维度分离基础之上增加了第四维肽段的碰撞截面积（CCS）--离子淌度（mobility）的分离，重新定义了蛋白质组学的分析标准。4D蛋白质组学基于timsTOFPro上的PASEF技术，大幅度的提高质谱扫描速度和检测灵敏度，实现蛋白质组学在鉴定深度、检测周期、定量准确性等性能的革命性提升。

实验流程

数据分析

技术优势

▶4D技术加持，更加适合微量样本

▶克服标记定量蛋白质组学技术在样本数量上的限制，灵活方便

▶采用布鲁克的timsTOFPro质谱平台，检测速度提升近一倍

针对4D蛋白质组学技术，金开瑞推出了4D Label-free、4D DIA和4D 磷酸化等4D翻译后修饰组学技术服务，为广大科研工作者提供高质量和全程售后的4D技术服务。

4D-DIA定量蛋白质组学

4D-DIA蛋白质组学是基于timsTOFPro离子淌度平台的新一代DIA技术，通过数据非依赖采集-同步累积连续碎裂（diaPASEF）扫描模式进行差异定量蛋白质组学分析。将DIA技术与基于timsTOFPro上的diaPASEF技术相结合，具有高扫描速度和高灵敏度优势的同时，外加第四维离子淌度分离，使DIA数据在采集时不牺牲窗口循环速度的同时，降低谱图复杂度和提高离子利用率，实现了蛋白质组学在覆盖深度、灵敏度、通量方面的全面性提升。

技术原理

蛋白质组学技术可分为数据依赖型（Data-dependentacquisition，DDA）策略，和数据非依赖采集（Data-independentAcquisition，DIA）策略。

1.DDA策略：在一级质谱中在每个时间窗口采集强度较高的有限肽段离子进入二级质谱进行碎裂分析；

2.DIA策略：将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，并循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测。

DIA技术可以无遗漏地获得样本中所有离子的全部碎片信息。因此，在定量上可以获得更多定量信息，且基于MS2信号，定量准确度更高，重复性更好。

实验流程

技术优势

1.近乎100%的离子利用率，极大提升检测灵敏度

在diaPASEF的扫描模式中，与离子淌度相关的CCS值和m/z之间有一定的相关性，因此四级杆可以利用这个特征逐步扫描来采集近乎100%的离子信号，极大提升检测的灵敏度和深度；而在DDA和传统的DIA模式中，这些信号只有一小部分可以被采集。

2.显著提升检测深度

4D-DIA技术可显著提升蛋白质组学检测深度，该技术在200ngHeLa裂解液的120分钟单针实验中，可以鉴定超过7500种蛋白质，并且三次实验的共同定量了6974个蛋白，数据完整性高达96%；而相比之下，在传统的DIA技术中，通常需要µg级的样品才能检测约5000左右的蛋白。

3.全面提升定量完整性

基于卓越的仪器性能和先进的采集方法，4D-DIA技术还可以进一步挑战灵敏度的极限。从仅仅10ngHeLa裂解液的120分钟单针实验中，能够鉴定到3323个蛋白，而相同实验条件下的4D-DDA模式只能鉴定到2723个蛋白。而即便是在如此衡量的情况下，4D-DIA在蛋白质定量上也能实现了85％的数据完整性。

数据分析

应用方向

▶临床微量样本最佳检测方式，如：外泌体、FFPE石蜡切片、活检穿刺组织等

▶临床大队列样本分析，如肿瘤、心血管等重大疾病精准分型

▶作物群体性状等大规模样本研究，如育种品系、胁迫干预等

▶临床生物标志物发现：DIA接近MRM的定量能力，实现标志物筛选与初步验证过程合二为一

▶生物样本信息库构建：DIA可实现生物信息的完整保存，为后续回溯分析提供保障。药物应答、基因敲除/过表达的蛋白表达谱分析

4D Label Free蛋白质组学

实验流程

技术优势

4D在鉴定准度、鉴定深度、定量准确性、检测周期上均有较大提升，样本量要求上较大程度降低，具体性能参数如下：

1.鉴定更精准

4维分离，蛋白鉴定的精确度更高。尤其是生物样本的蛋白质组成复杂，存在大量的共洗脱现象，在很小的保留时间内却存在大量共洗脱肽，质量差异（m/z）小。而离子淌度中对质量差异小的肽段进行区分（离子迁移率不同），实现更精准的鉴定。

2.鉴定数更多

相同测试条件下，4DLabel free比传统Labelfree技术检测能力提高50%以上。例如90min，4Dlabel free蛋白组鉴定到hela蛋白5200个，鉴定数提高62.5%；11.5min，4Dlabel free蛋白组鉴定到血液蛋白超过500多个，蛋白鉴定数提高50%。

3.定量更稳定

连续进样96针，R2>0.95，CV<5%，定量范围超过3个数量级。

4.项目周期更短

PASEF独特的采集模式，实现超高扫描速度，实验周期大幅缩减。

5.样本量要求更低

4D蛋白组的上样量降低到传统方法降低1/10，只需200ng。原始样本量降低到传统方法的1/4。只需少量样本，就能达到深度覆盖。

数据分析

应用方向

▶药物应答、基因敲除/过表达的蛋白表达谱分析

▶植物、微生物生长发育与胁迫逆境生理研究

▶疾病生物标志物与药物作用靶点高通量分析

▶蛋白作用机制与特殊功能蛋白质筛选

▶各种物种的蛋白质组草图构建

▶临床微量样本最佳检测方式，如：外泌体、FFPE石蜡切片、活检穿刺组织等

修饰蛋白组学实验思路

4D-修饰蛋白质组学

蛋白质磷酸化修饰（Phosphorylation）是生物体内最重要的共价修饰方式之一，是目前分布最多、也是最广泛研究的修饰，其发生过程是在激酶（kinase）催化下，将ATP的磷酸根基团转移到蛋白的氨基酸（Ser、Tyr、Thr）侧链上。

蛋白质乙酰化（acetylation）是指在乙酰基转移酶的催化下把乙酰基团（如乙酰辅酶A等供体）共价结合到底物蛋白质的赖氨酸残基上的过程，主要发生在蛋白质赖氨酸残基的ε-NH2位，其分子质量会相应增加42.01Da，质谱能够精确地测定分子量是否发生相应的质量偏移，实现酰化修饰肽段及位点的分析。

蛋白泛素化修饰（Ubiquitination）发生过程是通过一个三酶级联(E1-E2-E3)反应，使得单或多个泛素分子连接到蛋白氨基酸（Lys）侧链上，并常伴随蛋白酶体降解，调控蛋白表达水平变化。发生泛素化修饰的赖氨酸共价连接泛素分子，即两个甘氨酸K-ε-GG残基，使分子量产生114.1Da的质量偏移。利用质谱可精确测定分子量是否发生114.1Da的质量偏移，从而检测泛素化修饰肽段及位点。

4D-labelfree修饰组基于新一代timsTOFPro质谱仪，通过数据依赖性采集-同步累积连续碎裂（ddaPASEF）扫描模式进行修饰化差异蛋白质组学分析，利用了离子淌度分离，能根据分子的形状、截面积属性，可有效区分修饰同分异构多肽，极大提高修饰的鉴定深度，以更少上样量、更快扫描速度，实现蛋白质组学在覆盖深度、灵敏度、通量方面的全面性提升。

实验流程