Co-IP试剂盒（植物）

免疫共沉淀(Co-lmmunoprecipitation)是利用抗原与抗体之间的专一性作用为基础,从而用于研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的一种方法。抗体与裂解液中相应的蛋白结合后,再与ProteinA/G偶联的Sepharose或MagneticBeads孵育,通过离心或者借助磁力架获得ProteinA/G磁珠-抗体-目的蛋白复合物,在高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,收集上清,上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白,再通过Western Blot或质谱(MS)鉴定蛋白质。其原理图如下:

Q1：通过CoIP后WB验证发现，没有想要的目的条带？

A：多方面原因造成:

1）有可能是样品被蛋白酶降解，对应的策略是需要添加蛋白酶抑制剂，所有操作保持4℃以下冰上操作且避免反复冻融。

2）有可能是抗体浓度太低导致条带较浅，则需要调整IP或WB抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度。

3）抗体亲和力太低，选用适合于IP或者WB的抗体。

4）有的IP抗体未与磁珠结合，这种情况需选用适合IP的磁珠。

5）若Tag未暴露在融合蛋白构象的表明，则需改变Tag融合表达部位。

6）裂解液盐碱度太高，需用低盐碱度的裂解液。

7）抗体选择不当，更换抗体。

Q2：通过CoIP后WB验证发现，虽然可见目的条带，但是背景很高：

A：多方面原因造成:

1）由非特异带白结合导致背景高，若要避色主特异性带白结合，则需要在无血清溶液中裂解细胞，且在免疫沉淀前用protein(A/G)磁珠预洗免疫沉淀后增加漂洗次数和盐碱度(高盐或去垢剂)。

2）实验仪器或试剂被污染，使用洁净的仪器及实际。

3）转移膜上的目特异吸附导致背景高，实验操作过程中载手套，使用镊子来取，不要接触膜转移面。

4）制备样品中可能有不完全溶释的大的蛋白复合体，则在制备样品后进行知暂超声处理(3次，每次5秒钟 )，然后离心，取上清后进行后续试验。

5）洗涤不彻底，则需要多次洗涤，并设新增加洗涤液中的NaCl和去垢剂浓度。

6）可能有非特异性蛋白吸附于珠子上，则须进行Preclearing以排非特异性吸付。

7）抗体本身待异性不好可能导数者景高，则须选择合适的抗体，可以考虑单抗。

8）使用了过多的细胞或组织进行裂解导致背景高，则须减少样本量，推荐100-500ug细胞裂解物。

9）蛋白降解也可能出现高背景的情况，尽量使用新鲜制备的样品。

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