RNA pull-down试剂盒

RNA pull-down是研究细胞内RNA与蛋白/RNA结合情况的技术。先将RNA进行标记(如生物素标记),再与细胞裂解液共同孵育,从而形成RNA-RNA/蛋白质复合物,进而检测与之结合的RNA或蛋白质。复合物洗脱后,通过荧光定量PCR(RNA pull down-QPCR)或高通量测序(RNA pull down-seq)方法来鉴定目标RNA是否与某些RNA分子相互作用,通过Western blot(pull down-WB)实验和质谱(pull down-
MS)技术检测目标RNA是否与某些蛋白相互作用。

Q1: 实验全程如何预防RNA降解？

实验使用的所有试剂耗材需经过去RNA酶处理。

Q2：RNA pull-down⼀定要体外转录合成RNA探针吗？

体外转录只是获得RNA的⼀种⽅式，相比化学合成纯度更高。所以pull-down实验⼀般是体外转录得到目的RNA。当目的RNA序列大于2000bp时体外转录就不太容易转录成功，这时我们可以设计合成⼀小段目的RNA探针，通过探针与目的RNA结合，再与蛋白结合，便可绕过这个问题。

Q3：RNA在转录出来后，其OD⼀般都不高，可以使用吗？如何定量呢？

OD值不高可进行RNA纯化，即便不纯化在实验中多加⼀些RNA亦可。而定量问题⼀般会进行琼脂糖凝胶电泳检测，可以根据marker浓度来判断RNA的浓度。也可以用仪器测量RNA的浓度，但通过体外转录得到的RNA浓度都能达到2μg/uL以上。并且pull-down实验不需要精确的定量，都会加入过量的探针。

Q4：关于样本处理，细胞或者组织裂解时要不要加蛋白酶抑制剂或RNA酶抑制剂？还需要进行其他处理吗？操作过程中需要注意什么？

细胞裂解需要加⼊蛋白酶和RNA酶抑制剂，最好能够进行超声处理。另外裂解蛋白的全程尽量在冰上操作。

Q5：lncRNA引物设计有什么注意事项？或者说与普通的引物设计有什么区别？

体外转录扩增的引物只需要在正向引物5’端加⼊T7启动子序列即可。

Q6：质谱鉴定的蛋白主要是依据打分来进行筛选？这个筛选多少分算有效？

pull-down富集蛋白质谱分析后会剔除不可信蛋白，交付的都是可信蛋白，没有明确的打分。需要排序的话⼀般是根据鉴定蛋白特征性肽段的数目作为参考。

Q7：做lncRNApull down+质谱⼀般都会发现多个互作蛋白对吗？如何选择哪一种蛋白继续研究下去？

不同的RNA结合蛋白数量不等，根据实际鉴定的蛋白进行筛选；筛选的原则是根据自己研究的方向或相关功能确定这类蛋白。