实验原理
酵母核体系文库构建试剂盒，提供了一种从总RNA或者poly A+ RNA获得高质量全长cDNA文库的方法。本试剂盒在GAL4酵母单双杂的系统上，通过对PGADT7 序列载体进行改造，额外增加了三框文库的构建。本产品适用于从100 ~500 μg 不同来源的真核生物总 RNA 中，经过 mRNA 分离、单链 cDNA 合成、双链 cDNA 合成、双链 cDNA 分选、小量连接转化、大量连接转化，构建获得高质量的酵母cDNA文库。该试剂盒提供的试剂可以用来构建5个cDNA文库。相较于市面上其他的试剂盒，本试剂盒针对建库质量做了以下优化：
1.该试剂盒提供的反转录酶是市面上经过改造的MMLV 反转录酶，显著增加了反转录酶的热稳定性和半衰期，合成cDNA效率更高，片段长度完整性更好；
2.该试剂盒通过对PGADT7载体进行了移码突变，形成三个不同的读码框（命名为PGADT7-S1，PGADT7-S2，PGADT7-S3），相对传统以引物的方式引入的突变而言，新型的三框文库构建方式只需要合成一份双链cDNA，可以保证三框文库的片段长度，阳性率，文库滴度等信息的一致性。
3.该试剂盒在三框文库载体的基础上，通过引入CCDB自杀基因极大降低了空载的产生，基本实现100%阳性率；
4.该试剂盒提供的DH10B是经过了高抗性压力筛选的菌株，配合试剂盒中的最优方法制备的感受态以及对应的仪器工作条件，文库的转化效率能够达到至少1×1010；
5.该试剂盒提供的试剂与市面上其他公司相比，更加齐全，基本不需要再额外购买其他试剂材料。
实验流程
实验时间表
试剂盒组分
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分类 |
编号 |
组分名称 |
5T提供量 |
保存温度 |
存放位置 |
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引物 |
23009-1 |
SMART Oligonucleotide (10μM) |
10 μL |
﹣80℃ |
BoxA |
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23009-2 |
pPR3-F Primer(10μM) |
500 μL |
﹣20℃ |
BoxA |
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23009-3 |
pPR3-R Primer(10μM) |
500 μL |
﹣20℃ |
BoxA |
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23009-4 |
5' PCR Primer(10μM) |
100 μL |
﹣20℃ |
BoxA |
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23009-5 |
3' PCR Primer(10μM) |
100 μL |
﹣20℃ |
BoxA |
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23009-6 |
CDS III Primer |
20 μL |
﹣20℃ |
BoxA |
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试剂 |
23009-A1 |
RNA control |
10 μL |
﹣80℃ |
BoxA |
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23009-A2 |
dNTP mix |
100 μL |
﹣20℃ |
BoxA |
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23009-A3 |
5× FS Buffer |
30 μL |
﹣20℃ |
BoxA |
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23009-A4 |
DTT |
10 μL |
﹣20℃ |
BoxA |
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23009-A5 |
Reverse Transcriptase |
10 μL |
﹣20℃ |
BoxA |
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23009-A6 |
50× Advantage 2 Polymerase Mix |
20 μL |
﹣20℃ |
BoxA |
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23009-A7 |
10× Advantage 2 Buferr |
100 μL |
﹣20℃ |
BoxA |
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23009-A8 |
RNase H |
10 μL |
﹣20℃ |
BoxA |
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23009-B1 |
10× Restriction Buferr |
100 μL |
﹣20℃ |
BoxA |
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23009-B2 |
sfiI |
50 μL |
﹣20℃ |
BoxA |
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23009-B3 |
10× T4 DNA Ligase Buferr |
100 μL |
﹣20℃ |
BoxA |
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23009-B4 |
T4 DNA Ligase |
30 μL |
﹣20℃ |
BoxA |
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23009-B5 |
Glycogen |
50 μL |
﹣20℃ |
BoxA |
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23009-B6 |
NH4Ac(7.5 mM) |
1 mL |
﹣20℃ |
BoxA |
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23009-C1 |
DH10B |
200 μL |
﹣80℃ |
BoxA |
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23009-C2 |
pPR3-NS-1 Linearized plasmid |
10 μL |
﹣20℃ |
BoxA |
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23009-C3 |
pPR3-NS-2 Linearized plasmid |
10 μL |
﹣20℃ |
BoxA |
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23009-C4 |
pPR3-NS-3 Linearized plasmid |
10 μL |
﹣20℃ |
BoxA |
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23009-C5 |
2× PCR Master Mix |
5 mL |
﹣20℃ |
BoxA |
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23009-D1 |
Oligo (dT)25 beads |
1 mL |
4 ℃ |
BoxB |
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23009-D2 |
Binding Buffer |
5 mL |
4 ℃ |
BoxB |
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23009-D3 |
Washing Buffer |
5 mL |
4 ℃ |
BoxB |
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23009-D4 |
10 mM Tris-HCl |
5 mL |
4 ℃ |
BoxB |
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23009-E1 |
sodium acetate（3M，pH5.0） |
200 μL |
室温 |
BoxB |
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23009-E2 |
PCR-Pure Kit（10 columns，10 mL CP buffer，30 mL PW buffer） |
1 kit |
室温 |
BoxB |
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23009-E3 |
Xylene cyanol (二甲苯蓝） |
1 mL |
室温 |
BoxB |
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23009-E4 |
Purification columns |
5个 |
室温 |
BoxB |
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23009-E5 |
Column buffer |
20 mL |
室温 |
BoxB |
备注：试剂盒收到后按照组分信息中保存条件，将试剂依据要求存放，避免污染与反复冻融，稀释成工作浓度试剂即用即弃，不可重复使用！
