服务介绍
双荧光素酶检测是转录调控研究中十分重要的实验手段，主要应用于启动子和转录因子，以及miRNA和其靶基因互作的验证。
在双荧光素酶检测中，将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，海肾荧光素酶作为对照报告基因。实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达，而对照报告基因作为内对照。
以荧光素为底物来检测萤火虫荧光素酶活性，荧光素酶可以催化荧光素，在荧光素氧化的过程中会发出生物荧光，然后通过化学发光仪测定。
服务优势
- 灵敏度高：比Western blot灵敏度高1000倍以上
- 无报告基因： 植物、哺乳动物中无报告基因内源性表达
- 不受物质影响：荧光素酶检测不受细胞内其它物质影响
- 检测方便/范围广：检测范围广，大于7个数量级
服务流程
客户提供
基因模板，需提供详细的转录因子、目的基因、或microRNA信息；
实验细胞，如无特殊要求，金开瑞默认为使用293T细胞，则无需提供。
最终交付
- 实验流程及完整报告一份，包括实验原始数据、图片、分析结果等。
服务说明
| 服务名称 | 服务内容 | 交付内容及标准 | 服务周期（工作日） |
| 动物双荧光 | 靶点基因合成 | 含400bp以下，>400bp见附加单项 | 20 |
| 质粒提取 | 返还目的基因剩余质粒 | ||
| mimics合成 | 注：仅验证miRNA需合成mimics | ||
| 细胞转染 | 默认做4组，每组5生物学重复 | ||
| 双荧光素酶检测 | 交付结题报告及原始数据 | ||
| 植物双荧光（定量） | 质粒提取 | 返还目的基因剩余质粒 | 20 |
| 注射烟草 | 每片叶子上做4组，设5生物学重复 | ||
| 双荧光素酶检测 | 交付结题报告及原始数据 | ||
| 植物双荧光（定性+定量） | 质粒提取 | 返还目的基因剩余质粒 | 20 |
| 注射烟草 | 每片叶子上做4组，设5生物学重复 | ||
| 拍摄照片 | 交付3片叶子照片 | ||
| 双荧光素酶检测 | 交付结题报告及原始数据 |
案例展示
常见问题与解析 (Q&A)
a.启动子结构分析，将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体，检测其启动子活性。 b.启动子SNP分析，一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性。 c.验证特定转录因子同其调控序列的作用，将该序列（通常为启动子区域）插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转过表达该转录因子，可分析转录因子过表达是否提高荧光素酶活性。 d.可以分析信号通路是否激活，将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，在不同上游信号条件下，荧光素酶活性代表了通路的下游响应。例如在GPCR研究中，将cAMP response element（CRE）载入报告基因载体，构建稳定表达细胞株后，可以用于分析GPRC的激活与抑制剂筛选。又如，将HIF1α的响应原件hypoxia-responsive element (HRE)插入luciferase报告载体构建稳转细胞株，可以用于低氧相关通路的研究。 e.验证microRNA的靶序列，将待测的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，如果荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列。
Luciferase的灵敏度相比于GFP提高10-100倍以上，同时具有更宽的动态范围，便于数值分析比较，不需要荧光显微镜，而且在活体实验中其荧光穿透性高于EGFP等荧光蛋白，同时由于没有内源活性、其本底信号很低。 而GFP等荧光蛋白相比于荧光素酶的优势在于可以进行失踪定位，并且其观测不需裂解细胞，方便进行适时观察。
海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶相比，相对活性如何？ 在氧、镁和ATP的存在下，萤火虫荧光素酶作用于萤火虫荧光素，而来源于海洋腔肠（Renilla reniformis)的荧光素酶在氧的存在下作用于海肾荧光素。双报告基因技术（Dual-reporter assays）,结合了萤火虫荧光素酶测试和海肾荧光素酶测试。
转染效率低的话可以从三个方面改善，首先要确保细胞状态是好的，通常我们选出处于分裂期的细胞，另外阳性对照您可以选择过表达的荧光蛋白质粒，还有就是DNA的质量尤为重要，最好是先酶切验证。 这个实验检测结果很灵敏，有一定差异是正常的，通常只要确保它在一个数量级之内即可。如果差异超出这个范围可以从两方面改善，一是记住保持样本的均一性，二是加样要准确。
相关资源
1、在双荧光素酶报告系统研究中，一些常用网站、数据库和资源库的简介
● Promega（promega.com）：Promega是一个提供生命科学研究相关产品和服务的公司。他们提供多种荧光素酶底物和相关试剂盒，供科研人员在双荧光素酶报告系统实验中使用。
● Addgene（addgene.org）：Addgene是一个非营利性的生物资源库，提供了广泛的质粒和表达载体，包括荧光素酶相关的质粒，供研究人员用于基因转染和表达。
● NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）：NCBI（美国国家生物技术信息中心）提供了包括PubMed、GenBank、Gene等在内的多个数据库，可用于搜索和获取与双荧光素酶报告系统相关的文献、基因序列和蛋白质信息。
● PubChem（pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）：PubChem是NCBI的一个化学物质数据库，提供了大量的化合物信息和相关的生物活性数据，可以用于荧光素酶底物的筛选和选择。
2、双荧光素酶报告系统的实验步骤简介
①细胞培养和处理：
● 准备和处理目标细胞，确保其在适当的生长状态下进行实验。
● 维持适当的培养条件，包括培养基成分、温度和湿度等。
②底物处理：
● 加入荧光素酶底物和葡萄糖氧化酶底物以触发荧光发光反应。
● 优化底物浓度，确保使用浓度适当，以获得稳定且可检测的荧光信号。
③信号检测：
● 使用合适的设备进行荧光或发光信号的检测。
● 选择适当的检测方法，如荧光成像仪、荧光分析仪或酶标仪。
④数据分析：
● 进行相对荧光单位的定量分析，并设置负对照和正对照组。
● 使用合适的数据分析方法，评估实验结果的特异性和可靠性。
⑤实验重复和统计显著性：
● 进行足够的实验重复以确保结果的可靠性。
● 根据需要进行统计学分析，以评估数据的显著性和可靠性。
⑥实验条件控制：
● 保持实验条件的一致性，包括细胞培养条件、培养基配制、底物制备等。
● 严格控制实验的时间点和温度，确保实验操作在合适的时间窗口内进行。
⑦数据报告和结果解释：
● 撰写实验报告或论文，清晰地呈现数据和结果。
● 结合相关背景知识和文献，解释实验结果的意义和可能的机制。
3、除了双荧光素酶报告系统实验，还有哪些常用于研究基因表达调控和信号通路活性的实验方法？
① 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）：
▶ 使用特异性抗体将目标蛋白与其相互作用的分子（如蛋白质复合物或DNA序列）结合，并通过沉淀、洗涤和分析来鉴定和定量这些相互作用。
② 染色质免疫沉淀（ChIP，ChIP-seq）：
▶ 利用特异性抗体将某个蛋白质与染色质中的靶标位点结合，并通过免疫沉淀和测序技术，鉴定和分析该蛋白质在基因组上的结合位点及其调控作用。
③ 蛋白质互作分析：
▶ 利用蛋白质交联、共沉淀和质谱分析等技术，鉴定和分析蛋白质之间的相互作用关系，从而揭示基因表达调控和信号通路中的蛋白质网络。
④ 基因组学和转录组学分析：
▶ 利用高通量测序技术，如RNA-seq、ChIP-seq和ATAC-seq等，全面分析基因表达、染色质状态和转录因子结合位点，揭示基因调控网络和信号通路的动态变化。
