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喜讯！湖北省所有A级景区免门票，“5A级实验直播”免费！

信息来源：金开瑞 作者：genecreate 发布时间：2020-08-10 09:16:55

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2020年8月11日20:00
金开瑞第三期直播LIVE等你来！
和往期一样，在直播开始之前，先来了解一下我们本场“直播新秀EMSA”。
 
EMSA技术简介
        凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是一种检测蛋白质和DNA相互结合的技术，主要研究DNA结合蛋白与其相关的DNA相互作用。
 
实验原理
       基于蛋白-探针复合物在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。当DNA探针与目的蛋白混合孵育时，目的蛋白可以与末端标记的DNA探针结合，形成DNA探针-蛋白复合物，电泳时由于这种复合物比无蛋白结合的探针分子量更大，所以在凝胶中迁移的速度慢，即表现为相对滞后。
DNA探针-目的蛋白复合物如果在膜上形成一条滞后条带，说明目的蛋白与DNA探针发生互作，反之则不结合。
a) 实验设计说明
        根据研究目的合理设计特异性探针，还可根据需求设计突变探针或竞争性探针实验。
b) 样本制备
        可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白：总蛋白/核蛋白一般涉及超迁移，需要提供目的蛋白IP级别抗体；纯化好的蛋白则涉及重组表达，需要考虑目的蛋白重组表达难度。
c) 探针制备
        根据实验设计合成5’端生物素标记的引物，退火后形成生物素标记的双链DNA探针。
 
注意事项
a) 重组蛋白：
        蛋白尽量上清表达，且蛋白纯度需>80%
b) 核蛋白样品的制备：
        注意用专用的核蛋白抽提试剂来做，才能使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像；掌握好核蛋白的浓度和纯度，尤其是浓度；蛋白来源建议选择细胞（便于核蛋白提取）。
c) 探针的制备：
       建议合成生物素标记的引物直接进行退火；如果先合成探针再标记，可能会影响标记效率。
d) 探针长度选择：
       目的DNA的长度应小于300bp，太长会产生过多结合位点导致结果分析困难，还会产生超级螺旋结构而掩盖结合部位。建议选用短的寡核苷酸片段（60bp以内），这样可以确定具体的结合位点。
 
EMSA技术案例分析
a) 验证性EMSA（设计多个探针，确定结合位点）
验证性EMSA
The EMSA results of binding of AlgR to the rsmX/Y/Z promoter sequence.
From：The Pseudomonas transcriptional regulator AlgR controls LipA expression via the noncoding RNA RsmZ in Pseudomonas protegens Pf-5.
小结：EMSA设置阴性对照和阳性对照；同时验证AlgR蛋白与rsmX/Y/Z三段启动子区域结合情况，发现只有rsmZ+AlgR有滞后条带。
说明：AlgR蛋白可以与rsmZ启动子区域结合。
 
b) 验证性EMSA（设计WT和MUT探针）
验证性EMSA
From：The tomato HD-Zip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway.
小结：在明确结合位点的情况下设计野生型和突变型DNA探针，EMSA电泳时野生型DNA探针和纯化蛋白结合的复合物比无蛋白结合的DNA探针在凝胶中泳动的速度慢，显色后出现滞后条带；而突变型DNA探针则无滞后条带。    
说明：SIHZ24蛋白可以与SIGMP3启动子结合。
 
c) 竞争性EMSA（设计标记和未标记探针）
竞争性EMSA
From：Manipulation of Light Signal Transduction Factors as a Means of Modifying Steroidal Glycoalkaloids Accumulation in Tomato Leaves.
与探针序列相同，不标记修饰基团的DNA片段称为冷探针（竞争探针）。
作用：冷探针含有和探针相同的DNA序列，会干扰探针与蛋白的结合。在电泳图的相应位置处，电泳带的的信号减弱或消失。
优点：探针和蛋白的结合未必是特异性结合，或者蛋白本身可能含有生物素，二者均能产生假阳性的实验结果。增加一个冷探针的干扰实验，可以排除假阳性结果，增加实验结果的准确性。
 
d) 超迁移EMSA（需要IP级别抗体）
超迁移EMSA
From：Transcriptional regulation of microRNA-126a by farnesoid X receptor in vitro and in vivo.
小结：提取核蛋白后EMSA检测蛋白FXR与miR-216a启动子结合情况，由于核蛋白是混合蛋白，所以需要确定目的蛋白FXR则需要加入Anti-FXR进一步确认，发现DNA-蛋白滞后条带上方出现DNA-蛋白-抗体更滞后的条带（即超迁移）。
说明：核蛋白中与miR-216a启动子结合的蛋白是FXR。
 
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