知无不”研”|双荧光素酶报告基因实验结果不理想?看这里!
信息来源：金开瑞 作者：genecreate 发布时间：2020-11-24 08:59:31
miRNA可以与mRNA结合调节体内基因的表达，通过影响蛋白的表达、修饰、酶活性等来调节生命活动的进行。lncRNA作为体内的ceRNA，可以与miRNA结合起到调节基因表达的作用。研究lncRNA与miRNA的相互作用对于研究生命具有重要的意义。通过MS2-RIP和灵敏度更高的双荧光素酶技术，来研究lncRNA和miRNA的相互作用。
一、双荧光素酶报告系统服务简介
双光素酶报告基因通常是一个报告基因作为内对照，使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体和带有不同报告基因的第二个载体共转染培养细胞。通常实验报告基因偶联到调控的启动子，研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照，使测试不被实验条件变化所干扰。金开瑞应用Promega公司的双荧光素酶报告基因检测(DLR)系统，提供DLR检测服务。
二、双荧光素酶实验原理
萤火虫荧光素酶可以催化荧光素氧化成oxyluciferin，在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光，生物荧光可以通过酶标仪进行测定。
海肾荧光素酶可以催化腔肠素氧化成coelenteramide，在腔肠素氧化的过程中，会发出生物荧光，生物荧光可以通过酶标仪进行测定。
三、双荧光素酶实验应用
1.验证microRNA与靶基因（mRNA/lncRNA/circRNA）的互作
miRNA与靶基因结合后抑制靶基因的翻译，从而导致萤火虫荧光素发光值下降；当结合位点被突变后荧光值较对照组无差异性变化，证明miRNA是通过结合位点调控靶基因。
2.验证启动子与转录因子的互作
启动子和转录因子结合后萤火虫荧光素酶表达增强，从而导致荧光素发光值上升；当结合位点被突变后荧光值较对照组无差异性变化，证明启动子与转录因子有结合。
3.启动子结构分析
将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体，检测其启动子活性。
4.启动子SNP分析
一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用荧光素酶报告系统分析相对活性。
5.验证通路是否激活
将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，在不同上游信号条件下，萤光素酶活性代表了通路的下游响应。例如，在GPCR研究中，将cAMPresponseelement（CRE）载入报告基因载体，构建稳定表达细胞株后，可以用于分析GPCR的激活与抑制剂筛选。又如，将HIF1α的响应原件hypoxia-responsiveelement (HRE)插入luciferase报告载体构建稳转细胞株，可用于低氧相关通路的研究。
四、案例展示
图.双光素酶和RIP验证lncRNA可以与miR-26a结合（引自CCao, Zhang T, Zhang D. et al.The long noncoding RNA, SNHG6-003,functions as a competing endogenous RNA to promote the progression ofhepatocellular carcinoma. Oncogene. 2017 Feb 23;36(8):1112-1122.）
五、部分客户已发表文献
[1] Zhao G, Jiang K, Yang Y, Zhang T, Wu H, Shaukat A, et al. ThePotential Therapeutic Role of miR-223 in Bovine Endometritis byTargeting the NLRP3 Inflammasome. Front Immunol. 2018;9:1916.
[2] Guo T, Wang H, Liu P, Xiao Y, Wu P, Wang Y, et al. SNHG6 Acts as aGenome-Wide Hypomethylation Trigger via Coupling of miR-1297-MediatedS-Adenosylmethionine-Dependent Positive Feedback Loops. Cancer Res.2018;78:3849-64.
[3] Ma J, Liu C, Yang Y, Yu J, Yang J, Yu S, et al. C/EBPbeta ActsUpstream of NF-kappaB P65 Subunit in Ox-LDL-Induced IL-1betaProduction by Macrophages. Cell Physiol Biochem. 2018;48:1605-15.
[4] Zhao G, Yang C, Yang J, Liu P, Jiang K, Shaukat A, et al. Placentalexosome-mediated Bta-miR-499-Lin28B/let-7 axis regulates inflammatorybias during early pregnancy. Cell Death Dis. 2018;9:704.
直播预告
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2020年11月24日20:00
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