Protein & Cell噬菌体展示技术应用于肿瘤靶向肽的筛选

肽是氨基酸的二维线性链，通常长度短（小于50 AA）。通过合理的计算方法或噬菌体展示筛选来设计它们，以获得与目标靶标具有高特异性结合的肽，调节靶标的可能性。与抗体（约150 kDa）相比，肽相对较小（约3-5 kDa），因此易于合成和修饰，具有更高的细胞膜渗透性，免疫原性较低。在癌症治疗中，这些肽可用作靶向配体，协助将细胞毒性药物特异性递送至肿瘤血管，肿瘤微环境或癌细胞。另一方面，肽还可以在细胞内递送以靶向癌症特异性上调的转录因子，癌基因或酶。
如何应用噬菌体展示生物淘选技术寻找肿瘤靶向肽呢？2019年4月21日，来自广东省恶性肿瘤表观遗传与基因调控重点实验室的Er-Wei Song 研究团队在Protein & Cell (IF=10.164) 上发表了题为“Phage display screening of therapeutic
peptide for cancer targeting and therapy”的综述论文，讨论用于通过原位，体外，体内和离体筛选方法分离各种癌症特异性配体的噬菌体展示技术的改进。并且介绍了实体肿瘤靶向肽的突出例子，即通过噬菌体展示筛选确定的靶向肿瘤血管的肽，肿瘤微环境（TME）和癌细胞上的过度表达受体，以及在临床中基于靶向肽治疗剂的当前挑战和未来前景。

1、噬菌体展示技术和生物淘选策略
噬菌体展示是一种用于筛选和分离靶标特异性肽的强大技术。 该方法利用噬菌体通过将编码相应多肽的基因插入噬菌体基因组来在其表面上展示外源肽或抗体。 为了在噬菌体上展示外源多肽，将所需的DNA序列插入M13噬菌体pIII或pVIII基因中（图1）。 使用主要外壳蛋白pVIII的方法可提供多价展示，但是只能在pVIII基因上展示短肽（6-7 AA）。因此，大多数组合文库（例如抗体或蛋白质）都使用次要外壳pIII进行了展示。 由于每个噬菌体只能有3-5个pIII蛋白的拷贝，因此这种方法限制了拷贝数，但是可以限制表达的外源或合成多肽的长度（图1）。

图1、M13噬菌体的典型代表，其长度约为1,000 nm，宽度约为5 nm。
噬菌体选择方法，称为生物淘选，是一种分离靶标结合分子的亲和力选择过程。（图2），通常基于噬菌体展示的生物淘选由五个筛选步骤组成。第一步是“文库构建和扩增”，其中通过克隆组合DNA序列构建多肽展示的噬菌体文库。该文库将在生物淘选之前进行扩增。第二步是“靶标捕获步骤”，其将噬菌体文库与靶分子孵育特定时间以使其结合。第三步是通过重复洗涤“去除未结合和非特异性的噬菌体”去除任何未结合且非靶标特异性的噬菌体。第四步是“洗脱步骤”，在与低pH缓冲液短暂孵育后或通过竞争性洗脱，将目标结合的噬菌体分离出来。最后，在第五步“感染阶段”中，将洗脱的噬菌体感染细菌以扩增选定的噬菌体，从而形成了一个新的，更具选择性的噬菌体文库，该文库应用于下一轮生物淘选。
通常，需要三到五轮生物淘洗来分离特异性和高亲和力的结合肽，除去非特异性噬菌体，并通过增加洗涤次数和减少靶分子的量来增加每轮生物淘选的严格性，从而分离出对靶标具有高亲和力的噬菌体。 在生物淘选结束时，噬菌体ELISA和DNA测序用于鉴定对靶标具有高亲和力的个别特异性噬菌体。

图2、噬菌体展示技术的一般方案和高亲和力肽的生物淘选。
2、通过噬菌体展示筛选分离高亲和力肽的大量研究
尽管使用固定化抗原的原位噬菌体展示筛选能够产生高亲和力和特异性肽，为了更好地模拟细胞和身体状况，在体外，体内进行了大量研究，离体，甚至癌症患者）在异质环境中筛选高亲和力肽，因为这更接近其原始状况。研究方法有以下几种：1、均质的原位筛选仅需要将特定靶标包被在96孔上（图3A），单一靶标接触可确保分离靶标特异性肽，而不会受到非特异性结合的外部干扰。 这种方法也是最简单的，因为所有实验都可以在没有活体系统（即细胞培养，动物模型，患者样品）的情况下进行。2、体外细胞筛选提供了高通量的方法，可用于鉴定与单个细胞（即细胞系或原代细胞）特异性结合的多种肽，并可在贴壁细胞（活的或固定的）上进行（图3B）。3、通过在活体动物中进行生物淘选和选择，可以分离器官特异性肽（图3C）。4、离体筛选，在不分选细胞的情况下，在包含整个细胞群的载玻片上进行生物淘选（图3D）。5、为了减少小鼠和人类之间物种差异的相容性，据报道已针对人类患者筛选了噬菌体展示（图3E）。
 

图3、通过噬菌体展示筛选来捕获高亲和力肽的各种方法。
3、肿瘤靶向肽
肿瘤靶向肽是一种功能强大的工具，可用于癌症诊断和治疗，因为它们具有较低的生产成本和可以扩大规模，易于合成的优点。 靶向配体：对靶标具有高亲和力和特异性，与基于大型抗体的配体相比，具有较高的肿瘤渗透性。在实体瘤的复杂性中，肽可用于靶向功能异常的肿瘤脉管系统，致密的细胞外基质，肿瘤基质细胞或肿瘤上过表达的受体。通过噬菌体展示生物淘选技术鉴定的一些突出的多肽实例及其在生物医学领域中的应用如下：肿瘤微环境（TME）靶向肽，肿瘤血管靶向肽，肿瘤内皮细胞（EC）靶向肽，基质金属蛋白酶靶向肽，生成血管周细胞的靶向肽，细胞外基质（ECM）靶向肽，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）靶向肽，癌相关成纤维细胞（CAF）靶向肽，肿瘤靶向肽开发的靶标CD10+GPR77+ CAFs和CD146等等。

图4、特异性噬菌体与癌细胞系hCRC活检标本的结合
4、肿瘤靶向肽上的过表达受体
在癌症治疗中，过表达的受体受到靶向剂的调节，例如抗体，抗体片段，肽或小的化学物质，它们可以通过直接结合这些受体来阻断其活性，从而终止下游机制，阻断了癌症的进展。利用受体过表达来靶向递送抗癌药物或生物活性分子是无法区分癌症和正常细胞。配体充当它们的“眼睛”，将它们直接引向肿瘤细胞上过度表达的受体，从而在不伤害正常细胞的同时特异性攻击恶性细胞。目前已知有无数种靶向配体在各种癌症中过表达，不同的癌症类型和亚型，癌症阶段也不同。图5突出显示了截止2018年为止与癌症相关的前十大过表达受体及其在PubMed中的相应出版物。全面的文献综述显示（除CD44和Fas受体外），所有其他受体均已用作噬菌体展示生物淘选的靶标并且已经为这些受体开发了至少一种肽配体。
 

图5、截止2018年，PubMed中与癌症相关的前10大过表达受体及其相应报道。
5、细胞内靶向肽的缺乏：APT STAT3的案例研究
STAT3在其与癌症有关的信号通路中起着重要作用，因此受到了广泛关注。有文章报道STAT3结合肽的鉴定（APT STAT3，Kd〜231nmol / L）。 开发了APT STAT3与穿透细胞的肽9R（APT STAT3 -9R）的结合体，以增强细胞摄取。APT STAT3 -9R不仅阻断了STAT3的磷酸化，而且还降低了STAT下游分子在各种类型的癌细胞（黑素瘤，乳腺癌，肺癌，肝癌和脑癌）中的表达。此外，肿瘤内注射APT STAT3 -9R在异种移植和同种异体移植肿瘤模型中的抗肿瘤活性发挥了重要作用。提出了APT STAT3作为抑制STAT3的有力药物的临床证明，该药物可针对具有组成性激活的STAT3的多种癌症（图6）。

图6、肽的高效细胞内传递。
本文通过综合性的论述噬菌体展示技术在肿瘤靶向肽中的应用，阐述了噬菌体展示生物淘选技术为实体瘤治疗带来了巨大的高亲和力和高度特异性肽配体库。 这些许多基于肽的靶向配体在增强实体瘤治疗方面已显示出令人鼓舞的结果，包括与抗癌药或生物制剂组合使用时，增加的肿瘤蓄积，高度特异性的肿瘤靶向和增强的肿瘤抑制作用。但是，为了成功应用到到临床，应针对肽靶向配体的亲和力，水溶性和靶标特异性进行优化。随着技术的进步，现在可以使用结合的一级噬菌体展示筛选和二级计算优化方法来开发针对靶向实体瘤治疗领域中任何目标受体的最佳肽。
 
参考文献：Er-Wei Song, et al. 2019. Phage display screening of therapeutic peptide for cancer targeting and therapy. Protein & Cell.
Benekli M, et al. 2009.  Targeting signal transducer and activator of transcription signaling pathway in leukemias. J Clin Oncol .
 
 
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