【客户文献解读】定量蛋白质组学分析表明丝氨酸/苏氨酸激酶参与猪链球菌毒力和对压力条件的适应

猪链球菌（S.suis）是一种主要的猪病原体，可引起多种疾病。此外，猪链球菌是一种重要的人畜共患病原体。猪链球菌血清型2 (SS2)是毒性最强且最常从患病猪中分离的血清型，最常与人类感染有关。猪链球菌血清型2 (SS2)的真核型丝氨酸/苏氨酸激酶在细菌发病机制中起关键作用。在本研究中，用iTRAQ定量蛋白组学分析不同的蛋白质表达谱，特别是那些与细菌病原体有关的蛋白质表达谱，在野生-型(WT) 菌株SS2-1 及其SsSTK突变菌株，目的是揭示参与适应应激环境和猪链球菌毒力的蛋白质。

1、SsSTK突变株和WT株的比较蛋白质组分析

iTRAQ定量蛋白组学共鉴定了来自WT 菌株SS2-1 及其突变菌株Δstk 的1120种蛋白质。其中，与WT菌株SS2-1相比，Δstk中281种蛋白质的表达水平存在显著差异（>1.5倍变化或<0.67倍变化，P值<0.05），其中134种下调和147种上调。

2、DEPs的功能分类注释分析

为了深入了解281 种差异表达蛋白(DEP)的功能类别，进行了GO分析以生成基于生物过程和分子功能的分类簇（图1）。

Fig.1 GO enrichment analysis of differently expressed proteins in Δstk.Results are grouped by biological process (a) and molecular function(b)

3、DEPs的KEGG通路分析

为了揭示SsSTK 在SS2 中的作用，进行了KEGG 通路分析（图2）。DEPs主要参与代谢途径、次级代谢产物的生物合成和不同环境中的微生物代谢。一般来说，这些DEPs中的大部分都参与了关键的代谢和途径，这可能有助于SS2 的致病性。

Fig. 2 KEGG pathway enrichmentsin DEPs in Δstk. a Up-regulated and b down-regulated proteins

4、SsSTK 调节已知毒力因子

SsSTK 缺失显著降低了SS2毒力。在281种DEPs中，VFDB预测的毒力因子（VFs）有69种，其中Δstk中有38种下调蛋白（表1）和31种上调蛋白（表2），其中26种是SS2的已知VFs。

5、相互作用网络分析证实了新发现的 DEP 在已知毒力因子系统中的作用

为了进一步了解这些新发现的DEP在毒力中的作用，作者可视化了由SS2 的已知VF 和VFDB 使用Cytoscape软件预测的新识别VF 形成的网络。36种新发现的DEP（黄色节点）参与并补充了毒力相互作用网络，其中一些在连接已知VF（绿色节点和红色节点）并形成重要的枢纽蛋白方面发挥重要作用。总体而言，结果表明，69种新型DEP 中有37种参与已知毒力网络，并可能在毒力中发挥作用（图3）。

Fig.3 Interaction networks ofdifferentially expressed proteins predicted by the VFDB created usingCytoscape. Protein–protein interactions of differentially expressedproteins of S.suis that had a confidence score ≥ 0.4 werevisualized. The lines represent the interactions that exist betweenproteins

6、通过蛋白质印迹分析确认蛋白质组学结果

选择上调的VF DnaJ(41kD) 和下调的VF OppA(66kD) 来确认比较蛋白质组学分析。EF-Tu蛋白被用作内部参考，因为它的丰度在两组中相对恒定。蛋白质组学和western印迹的结果一致（图4）。

Fig.4 Western blot analysis ofcomparative proteomics data. Equal amounts (30 µg for each lane) oftotal bacterial cell proteins were separated on a 12% SDS-PAGE gel,then subjected to western blotting. From left to right the lanes wereloaded with SS2-1 and Δstk samples. Differentially expressed OppA(66 kDa, the first line), DnaJ (41 kDa, the second line) and EF-Tu(44 kDa, the last line) proteins were analyzed using their respectiveantibodies. The CBB-R250-stained gel was used as a loading control.Protein bands were visualized using the ECL substrate

总之，比较蛋白质组分析在突变株Δstk中鉴定了38种下调的VF，这些VF涉及在SS2感染期间对宿主细胞的粘附以及在宿主环境中的适应和存活。先前研究中的表型测定已经证实Δstk突变株在体外和体内的各种应激环境中表现出生长不足并减弱了致病性。因此，STK对细胞生长、应激反应和SS2 的毒力很重要。