分子互作专栏 | 蛋白-蛋白互作

    分子互作是生命体的普遍主题，分子互作技术作为生命科学的基础技术现已广泛应用于生命科学研究的方方面面。本文是分子互作专栏的第二篇文章，主题是“蛋白-蛋白互作”。

Co-IP原理

    免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，常被用于鉴定特定蛋白复合物中的未知蛋白组分，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

     其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的protein A/G预先结合固化在琼脂糖的磁珠上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的protein A/G就能吸附抗原达到精制的目的。

    补充：Protein A、Protein G是最常应用于抗体亲和纯化和免疫沉淀的蛋白。将Protein A、G分别固定在不同的介质上，或同时将Protein A、G共价偶联到介质表面，是从腹水、细胞培养物上清和血清中分离IgG和IgG亚家族的有效工具。
将蛋白样本Protein A和Protein G纯化IgG，IgG片段和亚类的基础是二者对IgG-类型的多克隆抗体和单克隆抗体具有很高的特异性亲和力。

Protein A 和Protein G

Co-IP技术路线
    1.Co-IP 前WB：提取样本总蛋白，通过抗体检测样本中靶蛋白的表达水平，如果检测到目的蛋白条带，则进行IP实验； 

    目的：验证靶蛋白和互作蛋白在目标样本内是否表达；验证抗体的特异性。

    2.免疫沉淀：用靶蛋白对应的IP级别抗体将靶蛋白从样本总蛋白中富集下来

    3.Co-IP后WB：对IP实验的IgG和IP组进行WB鉴定，如果IP组能检测到靶蛋白，而IgG组不能检测到靶蛋白，则说明富集成功；

    4.质谱鉴定：在IP成功的基础上，对IgG组和IP组进行银染SDS-PAGE检测，如果IgG组与IP组有明显差异，则对IgG组和IP组的样本进行质谱鉴定。

 

Co-IP免疫共沉淀的优缺点

优点：

    直接分析蛋白质的相互作用：Co-IP可以通过特异性抗体选择性地沉淀靶蛋白及其相互作用蛋白，从而直接研究它们的相互作用关系。

    保留蛋白质的生理环境：Co-IP通常在非变性条件下进行，能够保留蛋白质的天然构象和生物活性，有利于研究生物过程中的蛋白质相互作用。

    高度特异性：通过使用特异性抗体，Co-IP可以选择性地富集目标蛋白及其相互作用蛋白，降低非特异性结合的背景干扰。

    可用于低丰度蛋白质的分析：Co-IP可以有效富集低丰度的相互作用蛋白，增加对其研究的灵敏性。

    结合其他技术应用：Co-IP可以与其他技术，如质谱分析、Western blot等结合使用，进一步鉴定和验证蛋白质相互作用的特性。

 

缺点：

    限于已知的相互作用关系：Co-IP需要事先知道靶蛋白及其相互作用蛋白的抗体信息，因此对未知的蛋白质相互作用难以进行研究。

    假阳性和假阴性：Co-IP在实验过程中存在假阳性和假阴性的可能性，需要进行严格的对照实验和数据验证。

    依赖特异性抗体的质量：Co-IP的成功与否关键取决于抗体的特异性和亲和力，因此需要确保使用高质量的抗体。

    技术复杂性：Co-IP需要一系列实验步骤，包括免疫沉淀、洗涤、蛋白质解析和检测等，技术上较为复杂，需要经验丰富的实验者进行操作。

 

Co-IP项目风险点及解决方案

    风险点1：抗体非IP级别的或者抗体不能识别目标样本所属物种

    解决方案：选用IP级别并且能够识别目标样本物种的抗体

 

    风险点2：拉取互作蛋白中没有客户想要的（第一有可能是拉下来了，但蛋白信号弱，在其他高峰度蛋白的信号掩盖下，仪器未能识别到客户所想蛋白）

    解决方案：建议做WB直接进行验证，看客户所想蛋白是否在里面，WB会有信号放大作用，效果比质谱鉴定进行筛选更合适些，质谱只使用与广筛；第二可以尝试其他方式进行验证，例如GST pull down，酵母杂交等不同方法多角度进行尝试验

 

    风险点3：外源转入的蛋白在目标样本中不表达

    解决方案：尽量不要跨物种表达

 

    风险点4：标签蛋白转染细胞WB不能检测到目的蛋白：

    解决方案：推荐换标签或者换较为容易转染的细胞，另外尽可能的转染与基因所属物种最接近的细胞，避免物种间的排斥反应引起的不表达。

 

Co-IP送样指南
    Co-IP实验需要保证足够的蛋白浓度才能维持原本存在的蛋白互作状态，尤其当蛋白丰度较低、相互作用力不强、使用蛋白不易提取的组织样本等情况时。而且Co-IP的实验条件往往需要反复摸索。因此用于Co-IP实验需准备：

    ①细胞：Co-IP-WB细胞沉淀不少于80ul（至少2皿细胞量），Co-IP-MS细胞沉淀不少于100ul（大概4皿细胞），干冰寄送；

    ②动物组织：不少于0.5g，新鲜取材，干冰寄送；

    ③植物组织：不少于1g，新鲜幼嫩组织，干冰寄送

    抗体用量要求：抗体≥30ul抗体/次

 

Q&A

1、Co-IP 实验成功的评判标准是什么？

    在Co-IP-WB鉴定结果中，IgG组无目的蛋白条带、IP组有目的蛋白条带，说明IP过程成功；银染图中，IP组对于IgG组有更多蛋白条带、且存在差异，说明co-IP过程检测到互作蛋白；IP产物在质谱检测中鉴定到的蛋白数量不能作为判断实验成败的标准，因为这取决于目的蛋白本身所具有的互作蛋白数量、结合力强弱等方面。

2、IgG 组及IP 组均检测到目的条带，为什么？

    如果遇到这种情况可能是在切胶及质谱样品处理过程中发生了串染，对IP组中互作蛋白的结论没有影响，IgG组中的蛋白在文章中通常都不是考察对象。

3、Co-IP实验成败的主要因素？

    a.所使用的抗体不仅需要优秀的亲和力、特异性，其识别表位还可能被互作蛋白所掩蔽（主要是使用单抗时）；

    b.当蛋白互作须发生在特定生理代谢条件、组织细胞类型之中时，co-IP实验可能无法获得互作结果；

    c.如果诱饵蛋白和或捕获蛋白在样本中丰度很低时，会导致结果失败；

    d.两个互作蛋白的亲和力较弱；

    e.当该蛋白互作需要较特定的离子强度，或者需要如Ca离子/Mg离子/ATP等辅因子时，要创造合适的反应条件会变得困难；

    f.一些样品处理提取存在难度，提取足量目的蛋白与保持蛋白天然状态，需通过实验条件达到优化平衡；