分子互作 | 蛋白-DNA互作专题之酵母单杂交

    分子互作是生命体的普遍主题，分子互作技术作为生命科学的基础技术现已广泛应用于生命科学研究的方方面面。本文是分子互作专栏的第四篇文章，主题是“蛋白-DNA互作专题之酵母单杂交”。

 

  酵母单杂交-原理  

    酵母单杂交是在酵母双杂交基础上发展而来的一种体外研究DNA和蛋白质相互作用的技术，已经被广泛应用于科学研究的各个领域。

    其理论基础是许多真核生物的转录激活因子均具有两个功能上独立的结构域——DNA结合结构域和激活结构域，前者特异结合于顺式作用元件上，后者实施基因表达调控功能，单独的结合结构域或者转录激活结构域都不能启动下游报告基因的表达，酵母单杂交技术就是利用此原理构建各种基因与转录激活结构域所融合的蛋白，只要转录激活域所融合的蛋白能与特异的DNA序列结合。

    也就是说它能扮演转录因子结合结构域的功能，那么就会形成有功能的转录因子，从而实施基因表达调控，激活启动子下游报告基因的表达，人们基于酵母单杂交系统的酵母GAL蛋白即是一种典型的转录因子[1]。

原理示意图如下：

图片[2]:Cartoon illustrating the basic components of a Y1H assay.

 

  实验步骤  

    基因合成——诱饵、猎物重组质粒构建——诱饵自激活及毒性验证——杂交验证（酵母细胞共转化）——稀释点种验证（更多详细信息请咨询客服领取相关资料哦！）

  应用范围  

 

转录因子研究

    酵母单杂交可用于研究转录因子与DNA序列的特异性结合。通过构建诱饵包含启动子或增强子序列，并与猎物中的转录因子相互作用，可以鉴定和验证转录因子-基因调控序列的相互作用关系。

 

DNA结合蛋白鉴定

    酵母单杂交可用于鉴定与特定DNA序列相互作用的蛋白质。通过构建诱饵包含DNA结合序列，与猎物中的蛋白质相互作用，可以筛选和验证与该DNA序列特异性结合的蛋白质。

 

蛋白质相互作用网络

    通过酵母单杂交技术可以筛选和鉴定蛋白质间的相互作用关系，从而构建蛋白质相互作用网络。这有助于了解细胞内蛋白质相互作用的调控机制、信号传导途径和细胞过程的调节。

 

疾病相关蛋白质研究

    酵母单杂交可用于研究与疾病相关的蛋白质相互作用。通过构建诱饵包含疾病相关基因的序列，与猎物中的蛋白质相互作用，可以鉴定潜在的疾病相关蛋白质相互作用伙伴。

 

药物筛选和靶点鉴定

    酵母单杂交可用于筛选和鉴定与小分子化合物相互作用的蛋白质。通过将小分子化合物作为诱饵，与猎物中的蛋白质相互作用，可以评估潜在药物的靶点和相互作用机制。

常见问题与解析

 

如果诱饵可以直接激活报告基因，该如何处理?

    为保证诱饵蛋白功能的完整性，首先我们会考虑用3'AT/ABA进行背景抑制，但是由于这两种试剂对酵母生长具有较大的毒性，后续可能会影响文库筛选，因此在3'AT超过15mM,ABA超过1200ng/ml时我们会考虑将诱饵蛋白进行截断，通过查阅文献和相关数据库，截去转录激活的区域，需要注意的是，截去的这一部分很有可能会影响到互作结果。

 

酵母杂交发生假阳性的原因及解决方式

产生原因

    (1)由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用，或者其激活作用被外来蛋白激活。

    (2)AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合，也可以单独激活报告基因的表达。

    (3)BD和AD在文库中会有随机碰撞导致空间上的接近，以致下游报告基因的表达。

 

解决方法

    (1)对于点对点验证来说，可同时将诱饵和猎物进行自激活验证，减少假阳性的判定，但是一旦诱饵和猎物均产生自激活，后续自激活的处理方式(截短)会浪费较多的时间；(我们一般不采取这种解决方式)

    (2)由于每个报告基因上游的调控区各不相同，因此用不同的报告基因验证阳性，可用于排除或减少假阳性；(我们主要采用这种解决方式)

    (3)单杂启动子，我们主要采用将报告基因整合到酵母的染色体上，可以使基因表达水平文档，消除了由于质粒拷贝数变化引起的基因表达水平的波动而造成的假阳性。（更多详细信息可以通过“阅读原文”打开金开瑞官网进行了解~）
此外作为酵母单杂交的后续实验可以用EMSA以及双荧光素酶实验来辅助验证。
 

  参考文献：

[1] 张开慧.酵母单杂交技术的原理及应用[J].宁夏农林科技, 2012(02):31-32.DOI:10.3969/j.issn.1002-204X.2012.02.016.

[2] REECE-HOYES J S,MARIAN WALHOUT A J.Yeast one-hybrid assays:a historical and technical perspective[J].Methods,2012,57(4):441-447.