分子互作 | RNA-蛋白互作之RNA pull down

  RNA pull down-实验简介  

    RNA pull down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验方法之一。使⽤体外转录法标记⽣物素RNA探针，然后与胞浆蛋⽩提取液孵育，形成RNA-蛋⽩质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从⽽与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过WB实验检测特定的RNA 结合蛋⽩是否与RNA 相互作⽤。若待检测⽬的蛋⽩明确，选择WB鉴定；若不明确，则可选择质谱鉴定。
 

 

  应用背景  

 

    蛋⽩质与RNA的相互作⽤是许多细胞功能的核⼼，RBPs在转录后水平参与调控mRNA稳定性、LncRNA活性、应激、肿瘤发生发展、细胞凋亡等众多生物学过程，且与诸多人类疾病密切相关。因此，对RBPs-RNAs相互作用的研究和鉴定有重要意义。
 

  原理简介  

 

 

  实验流程  

 

（1）目标RNA的制备及生物素标记

    目标RNA制备的一般流程包括：

    构建RNA过表达质粒：基因合成+测序验证

    体外转录模板准备：设计含T7启动子引物；PCR扩增得到转录模板

    体外转录：以PCR产物为模板，体外转录得到目的RNA

（2）磁珠富集RNA

（3）RNA结合蛋白孵育

（4）RNA结合蛋白洗脱，银染质检：SDS-PAGE电泳银染检测富集蛋白的情况

（5）WB或者MS检测

（6）鉴定猎物：RNA用qPCR鉴定；已知蛋白用WB鉴定；未知蛋白用质谱鉴定
 

 

  样品类型  

 

    细胞或组织为主

        a）RNA 序列信息或对应 ID

        b）细胞：3×10^7（细胞沉淀不少于 80μL）

        c）动物组织：0.2g

    获取难易程度：细胞系扩大培养即可（推荐用细胞系，如果没有细胞系，则考虑组织样品）；其他样品获取难度根据实际情况去考虑即可；

    样品量：样品量直接影响提取蛋白的含量，最终影响富集蛋白量；

    其他物质的干扰等影响因素：在没有细胞系的情况下，选择组织样品。动物组织中脂肪等物质存在影响。
 

 

  应用延伸  

    RNA pull-down除了可以研究RNA与蛋白互作，也可以研究RNA与RNA互作，可通过探针法来研究。

	体外转录法	探针法
原理	将诱饵RNA标记为探针，直接将猎物吸附于磁珠上	针对难以转录的诱饵RNA，利用探针结合诱饵RNA，间接的把猎物吸附于磁珠上
对照	antisense	无意义序列探针
应用范围	诱饵RNA长度在300-1500bp	诱饵RNA太短或太长
优点	特异性强。体外转录得到的是纯的诱饵RNA片段，不存在其它RNA的非特异性干扰，也不存在同源性的问题，所以特异性强，结果可靠性高。	不需要体外转录步骤，所以相对来说更简单，可以适用于几乎所有的RNA。
缺点	需要扩增得到体外转录RNA模版，同时要体外转录得到目的RNA，而DNA扩增和RNA逆转录都是需要比较合适的条件合适的引物才行，太长或结构问题的会导致扩增或转录不出来，相对探针法更困难。	由于很多RNA在细胞里面存在序列接近甚至完全包含诱饵RNA的转录本，所以当碰到这种情况时没法设计探针，另外由于是间接性的钓取猎物，多了探针作为过渡，效率不一定有体外转录直接得到目的RNA做探针的效率高。

 

实验常见问题

RNA结合蛋白的亲和力不够的原因？

    可能的原因：

        1）结合缓冲环境没有优化；

        2）裂解不完全；

        3）磁珠用量不足；

        4）RNA探针用量不足。

    解决方案：

        1）优化孵育时间、温度、盐浓度等条件；

        2）增加裂解液和蛋白上样量的比例；

        3）增加磁珠或探针用量；

        4）确定生物素和链霉亲和素效率。

 

RNA结合蛋白没有结合的原因？

    可能的原因：

        1）靶蛋白量不足；

        2）缓冲体系不对；

        3）RNA探针和蛋白的亲和力本来就低。

    解决方案：

        1）增加上样蛋白量；

        2）应用低盐体系；

        3）加入交联试剂。

 

WB信噪比高的原因？

    可能的原因：

        1）阳性信号率低；

        2）一抗效率低；

       3）蛋白没有充分沽解。

    解决方案：

        1）增加一抗的量；

        2）用敏感度的化学发光液；

        3）用细胞裂解液预孵一抗；

        4）增加样品的量；

        5）确定有没有其他可能的结合情况；

        6）增加裂解液用量。

 

结合的非特异性高的原因？

    可能的原因：

        1）缓冲环境没有优化；

        2）缓冲环境严谨性低；

        3）样品没有裂解完全和裂解体系没有优化。

    解决的方案：

        1）优化孵育时间、温度、盐浓度等条件；

        2）使用严谨性高的缓冲体系；

        3）调低RNA探针和样品的比例；

        4）提高裂解液的量。

 

做RNA pull down+质谱一般会发现多个互作蛋白，对多个蛋白，如何选择就哪一种继续研究下去？

    不同的RNA结合蛋白数量不等，根据实际鉴定的蛋白进行筛选；筛选的原则是根据自己研究的方向或相关功能确定这类蛋白。
 

 

  案例分享  

 

Circular RNA circEsyt2 regulates vascular smooth muscle cell remodeling via splicing regulation

期刊：J Clin Invest  IF：11.864  发表时间：2021