细胞功能实验 | 一文读懂细胞增殖实验

一、细胞增殖实验之CCK8实验

01、实验原理

    CCK-8试剂中含有WST–8，WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan（甲瓒，是一种显色剂）。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶标仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。

 

02、实验流程

    1、将处理过的细胞胰酶消化后计数，接种1000个细胞至96孔板，每孔100μl培养基，将培养板置37℃，5% CO₂培养箱中培养0 h、24h、48h和72h；

    2、每孔加入10μl CCK-8溶液，用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照；

    3、在细胞培养箱内继续孵育0.5h，用酶标仪在450nm测定吸光度。

 

二、细胞增殖实验之克隆形成实验

01、实验原理

    克隆形成实验：克隆指单个细胞在体外持续分裂繁殖6代以上，其后代所组成的细胞群。光镜下，大于50个细胞，计数为1克隆。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

    平皿克隆形成试验：适用于贴壁细胞， 如正常细胞和肿瘤细胞；

    软琼脂克隆形成试验：适用于肿瘤细胞、 转化细胞和悬浮生长细胞；

    克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数） × 100%

 

02、实验流程

    1、取对数生长期的单层培养细胞，用0.05%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10%FBS的培养基中备用；

    2、根据增殖能力将细胞以适当的密度接种于6孔板中，置37℃,5% CO₂ 培养箱中，静置培养2～3周；

    3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养；

    4、弃去上清液，用PBS 小心清洗2次；

    5、加入4%PFA固定15min，弃去固定液；

    6、加适量结晶紫染色液染色10～30min，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥；

    7、计数/Image J分析染色面积。

 

三、细胞增殖实验应用延伸

01、有哪些检测细胞增殖的方法？

    在细胞增殖检测中，MTT、CCK-8和Colony Forming是常用的方法之一。它们都有各自的优势和适用范围，因此使用频率相对较高。

    MTT测定和CCK-8测定是常用的间接评估细胞增殖活性的方法，特别适用于高通量筛选和快速获得结果。它们在细胞代谢活性的评估方面比较方便，因此在许多实验中被广泛采用。

    Colony Forming实验则被用于评估细胞的克隆生成能力和增殖能力，通过直接观察和计数形成的细胞集落来推断细胞增殖能力。这种方法在研究细胞增殖能力和克隆性方面更为直接，常用于细胞生物学和肿瘤学研究中。

    其他的细胞增殖检测方法如BrdU标记、Ki-67免疫染色、流式细胞术和细胞计数等也在特定的研究领域和实验中得到广泛应用。

    总体而言，选择使用哪种方法取决于研究的目的、细胞类型、实验条件以及实验室的偏好。不同的方法可以提供不同的信息和实验结果，所以在设计实验时需要综合考虑各种因素。

 

02、细胞增殖检测方法的介绍和优劣势对比

方法	原理	优势	劣势
MTT测定	细胞将MTT溶液还原为紫色结晶体，通过溶解和测量吸光度评估细胞增殖活性	简单、成本低、适用于高通量筛选	不能直接确定细胞数量，耗时
CCK-8测定	细胞将CCK-8溶液中的染料还原为有颜色的产物，通过测量吸光度评估细胞增殖活性	快速、简便、适用于高通量筛选	不能直接确定细胞数量，对少量细胞可能不敏感
Colony Forming	细胞形成集落，通过计数集落数量评估细胞增殖能力	直接评估细胞克隆生成能力和增殖能力	较长培养时间，依赖细胞克隆生成能力
BrdU标记	细胞在培养基中摄取BrdU，通过检测BrdU存在来评估正在进行DNA复制的细胞	直接标记正在进行DNA复制的细胞	需要特定抗体，不能区分细胞阶段
Ki-67免疫染色	检测细胞中Ki-67蛋白的表达，其在细胞增殖过程中高表达	直接标记正在进行细胞增殖的细胞	不能区分细胞阶段，依赖特定抗体
流式细胞术	利用流式细胞仪检测细胞数量、大小和DNA含量等参数	快速、可获取多个参数信息	对设备要求较高，需要单个细胞悬浮
细胞计数	通过显微镜观察和手工计数细胞数量来确定细胞增殖	直接计数细胞数量	耗时，适用于少量细胞和小培养皿

 

四、案例分享

当涉及到细胞增殖检测方法的使用时，一些常见的研究领域和实验应用的示例：

 

01、肿瘤学研究

  ▶ MTT测定：评估肿瘤细胞系对抗肿瘤药物的敏感性和抗药性。

  ▶ Colony Forming：评估肿瘤干细胞的克隆生成能力和增殖能力。

  ▶ Ki-67免疫染色：检测肿瘤组织中Ki-67的表达水平，评估肿瘤细胞的增殖活性。

 

02、药物筛选和毒性研究

  ▶ CCK-8测定：进行高通量筛选，评估化合物对细胞增殖的影响。

  ▶ 流式细胞术：测定细胞周期分布，判断药物对细胞周期的影响。

  ▶ MTT测定：评估药物或化合物的细胞毒性作用。

 

03、组织工程和再生医学

  ▶ Colony Forming：评估干细胞的增殖和分化能力，用于组织工程和再生医学研究。

  ▶ 细胞计数：计算细胞数量以确定组织工程支架的细胞种植密度。

 

04、免疫学研究

  ▶ BrdU标记：标记正在进行DNA复制的免疫细胞，评估免疫细胞增殖活性。

  ▶ Ki-67免疫染色：检测免疫细胞中Ki-67的表达，评估其增殖能力和激活状态。

这些只是一些示例，实际上在各个研究领域和实验中可以使用不同的细胞增殖检测方法。选择合适的方法需要考虑研究问题、细胞类型和实验条件等因素，并根据实验目的进行决策。