动物实验设计过程中的关键点有哪些？注意事项

    众所周知，无论是在科研课题设计，还是在药物临床前实验阶段，动物实验都扮演者重要的角色，通过动物实验我们能够：

    1. 确定潜在的作用靶器官和治疗作用出现的时间、性质、程度及其可逆性；

    2. 确定临床监测的指标和安全性参数；

    3. 便于探究疾病潜在作用机制和相关信号通路。

 

    它的完整性、合理性、论证性直接决定着这个课题或者这个项目的水平。也就是说，在实验开始之前，必须把所有细枝末节给想清楚（万一没整明白，杂志编辑又要你补，就该傻眼了），这里可以让动物实验经验丰富的师兄师姐或者负责动物实验这块儿的老师听听你的方案，或许有时候他们一句话就能点醒一个“蒙鼓人”。

    往往一个完整的动物方案，它还会把后续的统计学给考虑进去，比如说这个统计数据，杂志要求n等于几，中途鼠如果挂了，会不会影响我们最后的统计结果。如果没设计好，我们不仅得不到有用的数据，而且你想看出什么趋势来，也很难。况且，后续如果要补做的话，费时又费钱，你导多多少少也会有点生气吧，所以前期要优化实验方案、优化统计学方法、优化实验动物只数，争取一批实验就把所需要的数据都拿到。

    具体来讲动物实验要注意哪些内容呢，有哪些原则要遵循，我们一块儿看一下。
 

一、动物实验设计的原则

 

01、动物福利和伦理性原则

    这是我们设计时候的第一原则，实验者须在设计中确保本动物实验方法和目的符合人类的道德伦理标准和国际惯例，在动物实验期间遵守实验动物伦理福利原则和动物实验室的规章制度，一般好点的杂志也会需要你提交动物实验伦理证明，他要看你动物实验过程中有没有违规，注意的点比如肿瘤造模的体积，最后动物处死方法，组织取材方法等。

 

02、随机性原则

    按照机遇均等的原则进行分组，使一切干扰因素造成的误差尽量减少，减少主观偏倚，这个一般是用随机数表法、卡片抽签法等进行选取。

 

03    对照性原则

    在实验中设立对照组动物，是为了与实验组动物有一个直接对应的关系，以消除过多变量和未知变量对实验结果产生的影响。

（1）空白对照：是模拟处理组过程而实际上没有给予受试物或处理，有时也称假手术组。

（2）阴性对照：造模后不做任何处理或以不具药理作用的物质处理实验动物，保证未知变量对实验组动物引起相反的效应不存在，即排除假阳性结果。

（3）阳性对照：用已上市或有明确的药理活性的药物处理动物，作为一个标准测量各实验组间差异的程度，用以排除实验方法本身是否存在问题和评价实验组药物效果。

（4）实验组对照：在药理学和毒理学试验中，实验组还分成多个剂量组，以此观察不同剂量的量效关系，不同剂量组也可互视为剂量对照组。

 

04、重复性原则

    同一处理要设置多个样本例数n，其目的是增强代表性，增加可信度，样本数要适中，这个就是我们前面说的要保证动物只数。一般大小鼠的话，一组最好设置10~15只，这个考虑到后续要统计动物的神经行为学啊（这个一般要求的只数比较多），有些组织要送去制成蜡块，进行切片、染色啊，要做一些生化指标的测定啊，要做WB实验或者一些PCR的实验啊……这些都是在前期要考虑好的，有的组织样本比较少，比如肾上腺、脑海马区、胰腺、消化腺等，可能没做几次实验呢就没了。

 

05、一致性原则

实验组与对照组除了处理因素不同，其他非处理因素基本保证均衡一致，均衡一致是处理因素具有可比性的基础，它下面又包含很多细小的分支。

（1）鼠来源和生理状态要尽量一致：比如说鼠就选择同一个供应商繁育的，避免出现虽然是同一种属，但是表现和行为不一样的情况。然后生长周期要尽量一致，同一周龄，体重相近，尽量雄性（有的实验要避免雌激素影响）。

（2）实验环境和饲养尽量一致：实验大小鼠对生活环境比较敏感，一些轻微的环境改变就容易引起行为学和生理学，我们一般在随机分组完成后，要先让鼠适应一周后，才会开始进行模型处理，这段时间要保证鼠笼位置相对恒定，鼠笼的通风口正常通风，然后食物、水源都能够熟练获得，同时会注意到鼠笼内部的社会阶层基本建立（一般5只鼠一笼会有一个“鼠老大”，比较凶）。

（3）实验人员要保持一致：不同的人抓鼠的力度不同，注射的深度和熟练度不同，可能对鼠的状态有一定影响，而且鼠嗅觉比较好，不同的人气味会有不同，所以尽量保证实验操作员是同一组人，而且注射技术要比较好，以减少鼠的应激反应。

（4）给药时间尽量保持一致：有的时候我们要连续给药三周到一个月的，最好固定时间去给老鼠注射，比如固定下午两点去给药或者早上给药，我之前习惯是上午去给药，一般这个时候鼠比较安静，好抓，或者前一天晚上禁食，第二天早上去先测指标，然后再给药、给食。
 

二、实验设计步骤

 

    实验原则搞清楚了，我们就要开始正式设计实验了，当然设计实验也有一定的逻辑顺序在里面，要一步一步进行。

 

01、查文献资料

    查文献要广泛、细致，看综述了解当前研究的最新进展，聚焦在哪个方向上，明确要用的研究方法、模型构建方法、实验分组、检测指标等等，一些别人已经发了很多文章的方向就没有必要再重复研究了，找个好的切入点，找到没有几篇文章的研究方向再仔细研究。

 

02、定初步方案

    根据当前实验室的条件，定下可行的实验方案，包括造模方案和依据、给药途径、药物剂量、实验人员、需要的仪器和试剂等等。还要注意的是，这里也要注意下花费，毕竟涉及到钱的问题，大家还是要谨慎点。

    还有个要注意的问题是时间，整个实验需要多久、造模用多久、给药多久、中途什么时候确定模型进展、最后什么时候取血或者取组织等，这些内容都应该形成一个protocol，按照这个开展。我们组的习惯是，组会开始前，这个动物实验负责人把实验过程中所有的事件列在一个表格里（例如买鼠、造模、模型评价、取材、动物无害处理等），后面备注时间、参与人员，具体分工等，然后大家一块儿讨论哪里不合理，哪里时间、人员上要调整，集思广益。

 

03、预实验

    前面初步方案已经定了吧，下面就要开始小规模的预实验了（每组3~4只），目的是通过预实验将操作和使用的技术更加完善，实验者在这过程中慢慢学会打配合、注射技术进一步熟练、优化实验中的细节，为下一步正式实验做准备。

    在这一步就要想好几个问题，剂量安不安全、对照设置合不合理、逻辑上有没有缺陷、实验大概需要多久、各组检测指标有没有差异，这些如果有问题就要尽快调整，实在没有任何差异的时候要及时止损，换个方向，以免鼠财两空。

 

04、正式实验

    在基本成熟的实验条件和人员配置下，按照方案开始正式实验。

 

三、其他注意事项

    1、最后动物取材的时候可以简单弄成流水线，取血的，取内部器官组织的，样本编号记录的，样品和遗体整理的，分几个人做，以免标错组别，或者把组织放错管子了，那就麻烦大了。

    2、数据建议及时录入和整理，因为数据量太大了！一只鼠一个体重和血糖之类的数据，80只鼠就是80个体重血糖，一周测一次，期间还要给药、做其他指标检测，一个月下来数据会很多。

    3、鼠种、给药剂量、给药周期每篇文献不一定一样，多看几篇高分的文献再确定，有时候要根据人的用药量进行换算，剂量一般按等差或等比设置，检测指标一定要能突显你的研究内容。

    4、有些非极性药物微溶或不溶于水，要么想办法增大溶解度，要么选用玉米油、大豆油等作为药物溶剂，缺点就是黏度比水大，不好注射。

    5、最后取完血，取完组织后，一些酶类的指标或者一些血液指标要尽快测，最好三到五天测完，因为有些酶放不了很久就失活了，影响实验结果。