RNA-蛋白互作 | 一文读懂RIP、RNA pull-down和MeRIP

    RNA和蛋白质相互作用是指RNA分子与蛋白质分子之间的物理、化学或生物学相互作用。RNA可以通过与蛋白质相互作用来调控蛋白质的功能，而蛋白质也可以影响RNA的结构和稳定性。这种相互作用可以对细胞和生物体内的各种生物学过程产生重要影响，包括基因表达、蛋白质合成、细胞信号传导等。

    RNA和蛋白质相互作用在许多疾病的发生和发展中发挥关键作用，深入了解这些相互作用可以帮助我们识别疾病的潜在机制，并寻找新的治疗靶点。在药物研发中，许多药物是通过干扰特定的RNA-蛋白质相互作用来实现其治疗效果的。因此，RNA和蛋白质相互作用的研究可用于分析基因表达、疾病标志物的检测和药物筛选等方面，帮助设计更有效的药物。

    RIP、RNA pull-down和MeRIP等实验技术是我们深入研究RNA和蛋白质相互作用的关键工具。RIP用于选择性地富集与特定RNA相互作用的蛋白质，RNA pull-down通过RNA探针捕获相互作用蛋白质，而MeRIP则用于甲基化RNA的研究。下面就让我们详细了解一下。

 

1、RIP

    RIP，全称为RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay，RNA 结合蛋白免疫沉淀，其主要目的是富集RNA分子和与之相互作用的蛋白质，以便进一步分析这些相互作用的性质和功能。

RIP的基本步骤如下：

    ① 交联： 首先，将细胞或组织样本进行交联，通常使用交联剂（如甲醛）处理，以稳定RNA和与之相互作用的蛋白质。

    ② 细胞裂解： 细胞或组织样本被裂解，使RNA和蛋白质释放到溶液中。

    ③ 免疫沉淀： 将特定抗体加入样品中，这些抗体能够识别并结合感兴趣的蛋白质。这些抗体与目标蛋白质结合后，形成免疫复合物。

    ④ 沉淀： 使用蛋白质A/G磁珠或其他材料，将免疫复合物沉淀下来，同时将未结合的RNA和蛋白质分离。

    ⑤ 洗涤： 对沉淀下来的免疫复合物进行多次洗涤，以去除非特异性结合的杂质。

    ⑥ 去交联： 通过加热或酶处理，解除RNA和蛋白质之间的交联，将它们释放到溶液中。

    ⑦ RNA提取： 从免疫复合物中提取RNA，使其可以进行后续的分析，如逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、RNA测序或微阵列分析。

 

 

2、RNA pull-down

    RNA pull down的主要目的是通过特定的RNA分子（通常是已知的非编码RNA或mRNA的片段）来富集与之相互作用的蛋白质，以便进一步研究这些相互作用的性质和功能。

RNA pull-down的基本步骤如下：

    ① RNA标记：首先，标记目标RNA分子（通常是合成的in vitro转录RNA），通常使用生物素（biotin）标记。这种标记的RNA片段可以被用作“鱼饵”来捕获与其相互作用的蛋白质。

    ② RNA与细胞提取物相互作用：标记的RNA片段被加入细胞或组织的提取物中，使其和与之相互作用的蛋白质结合形成RNA-蛋白质复合物。

    ③ 亲和富集：标记的RNA片段及其相互作用的蛋白质复合物可以通过生物素和亲和纤维素（如琼脂糖琼脂糖珠）的相互作用来富集。这种亲和富集的步骤将RNA-蛋白质复合物从总提取物中分离出来。

    ④ 洗涤： 富集的RNA-蛋白质复合物被多次洗涤，以去除非特异性结合的蛋白质和其他污染物。

    ⑤ 蛋白质识别： 最后，富集的蛋白质可以通过质谱分析、Western blotting等技术来鉴定和分析。

 

 

3、MeRIP

    MeRIP，全称为Methylated RNA Immunoprecipitation（RNA甲基化免疫沉淀），是一种用于研究RNA上的甲基化修饰以及与甲基化RNA相互作用的实验技术。其主要目的是富集甲基化的RNA分子，并进一步分析这些RNA分子的甲基化模式以及与其相互作用的蛋白质。

MeRIP的基本步骤如下：

    ① RNA修饰： 首先，RNA样本中的甲基化位点通常会通过碱基特异性甲基化酶进行修饰，将甲基添加到RNA分子的特定碱基上，如腺嘌呤（adenine）或胞嘧啶（cytosine）。

    ② RNA与甲基化抗体相互作用：修饰后的RNA与抗体（通常是特异性识别RNA甲基化的抗体）相互作用，形成RNA-抗体复合物。这些抗体能够识别并结合甲基化的RNA分子。

    ③ 免疫沉淀：将免疫复合物通过蛋白质A/G磁珠或其他材料进行免疫沉淀，将富集甲基化的RNA与与之相互作用的蛋白质分离出来。

    ④ 洗涤：对免疫复合物进行多次洗涤，以去除非特异性结合的杂质。

    ⑤ RNA提取： 从免疫复合物中提取RNA，使其可以进行后续的分析，如逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、RNA测序或甲基化位点鉴定。

 

三种技术的对比分析如下：

    总的来说，RIP、RNA pull-down和MeRIP是用于研究RNA与蛋白质相互作用或RNA甲基化的重要实验技术。它们各自适用于不同的研究场景，具有一定的优势和局限性。选择合适的技术取决于研究问题的具体需求和样本类型。

 

案例分享

CircPVT1 promotes proliferation of lung squamous cell carcinoma by binding to miR-30d/e.

J Exp Clin Cancer Res.(IF=11.161)

    环状RNA(circRNAs)是一类新型的广泛存在的非编码RNA，可以调控不同的人类疾病，包括癌症的发生发展。然而，关于circRNAs在肺鳞状细胞癌(LUSC)中的潜在机制和临床意义的信息还很少。

    本研究使用RNA测序(RNA-seq)技术对8个LUSC组织和9个健康肺组织中的RNA表达谱进行了分析。qRT-PCR用于分析circPVT1的表达及其与LUSC预后（即生存分析）的关系。此外，进行了体外和体内实验评估circPVT1对肿瘤生长的影响。进一步进行了RNA pull-down实验、质谱分析、双荧光素酶报告基因分析和RNA免疫沉淀实验，以探究circPVT1、HuR或miR-30d/e在LUSC中的相互作用。

    我们的数据显示，circPVT1在LUSC组织、血清和细胞系中上调。表达circPVT1较高的LUSC患者生存率较短。体内和体外数据显示circPVT1促进LUSC细胞的增殖。此外，机制分析显示HuR调控circPVT1。另一方面，circPVT1作为miR-30d和miR-30e的竞争性内源性RNA(ceRNA),在减轻miR-30d和miR-30e对其靶基因cyclin F(CCNF)的抑制影响方面发挥作用。

    综上所述，circPVT1通过HuR/circPVT1/miR-30d和miR-30e/CCNF级联通路促进LUSC进展。此外，它还作为LUSC诊断的新型生物标志物或治疗靶点。

CircPVT1 is actively induced by HuR.a Silver staining of biotinylated circPVT1-associated proteins;b Western blotting of HuR from circPVT1 pull-down assays;c RIP confirmed the relationship between circPVT1 and HuR in H520 cells.GAPDH mRNA was used as a non-HuR target control.