EMSA凝胶迁移或电泳迁移率实验技术

    凝胶迁移或电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)是一种研究蛋白与核酸（包括DNA和RNA）相互结合的技术，可用于定性或定量分析。蛋白质可以与生物素标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。

 

 一、EMSA的类型 

01、验证型EMSA

    用于验证探针是否含有可与蛋白质结合的位点。将结合位点突变，以突变探针为对照，野生型探针出现迁移条带，而突变探针未出现迁移条带，则说明该探针含有可与蛋白质结合的位点。

 

02、竞争型EMSA

    探针序列不变，不含修饰基团的探针称为冷探针。冷探针与标记探针竞争性地与蛋白结合，冷探针不显影出迁移条带。以冷探针为对照，标记探针出现迁移条带，而冷探针迁移条带减弱或消失，则排除了假阳性干扰，增加实验结果准确性。

 

03、超迁移EMSA

使用目标蛋白的特异性抗体，蛋白-探针复合物被抗体识别井结合，该三聚复合物在凝胶电泳中，迁移速率再次增大，出现在蛋白探针复合物的上方的超迁移条带，验证了探针与目的蛋白的特异性结合。
 

 二、EMSA的实验步骤 

01、准备探针

    ●合成或购买与目标DNA或RNA片段互补的探针。

    ●标记DNA或RNA探针，通常使用生物素标记或荧光染料进行标记。

 

02、提取和纯化蛋白

    ●从细胞或组织中提取目标蛋白。

    ●对蛋白进行纯化和浓缩。

 

03、准备反应体系

    ●将标记的DNA或RNA探针与提取的蛋白混合，形成蛋白-核酸复合物。

    ●添加适当的缓冲液、非特异性竞争物质（例如非标记的DNA片段）和/或抗体（用于超迁移抑制实验）。

 

04、电泳分析

    ●将蛋白-核酸复合物加载到聚丙烯酰胺凝胶上。

    ●在电场中进行电泳，使复合物根据大小和电荷迁移。

    ●分析电泳结果，观察是否有新的、迁移速度变慢的带，这些带表示形成了蛋白-核酸复合物。

 

05、蛋白-核酸相互作用的确认

    ●可以进行超迁移抑制实验，即加入抗体或竞争物质，观察是否能够改变或消失特定带。

    ●可以进行多样性实验，例如逐步增加蛋白量，以观察迁移带的变化。

    请注意，具体的实验步骤可能因实验设计和所用试剂的不同而有所变化，因此在进行实验前请参考相关文献或厂家操作手册。

 

 三、EMSA的应用 

    EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质与核酸之间的相互作用。它在许多研究领域中得到广泛应用，包括但不限于以下几个方面：

    ● 转录因子研究：EMSA可用于研究转录因子与DNA的结合。通过分析转录因子与特定基因启动子或调控元件的结合能力，可以揭示基因调控网络和转录调控机制。

    ● RNA结合蛋白研究：EMSA可用于研究RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）与RNA的相互作用。通过探究RBPs与目标RNA序列的结合，可以了解RBPs在转录后调控、RNA稳定性和翻译调控等过程中的功能。

    ● DNA修复和损伤识别：EMSA可用于研究DNA修复酶和损伤识别蛋白与DNA损伤位点的结合。通过分析这些相互作用，可以深入了解DNA修复机制和DNA损伤应答通路。

    ● 药物筛选和药物靶点研究：EMSA可用于筛选和评估潜在药物分子与特定DNA或RNA序列的结合能力。通过检测药物与靶点的相互作用，可以评估药物的亲和力和选择性，为药物开发和靶向治疗提供重要信息。

    ● 基因调控网络研究：EMSA可用于研究基因调控网络中的转录因子与调控元件之间的相互作用。通过分析转录因子与特定启动子或增强子序列的结合，可以揭示基因调控网络的结构和功能，以及转录因子在调控基因表达中的作用。

    ● 疾病相关基因的功能研究：EMSA可用于研究与疾病相关的基因的功能调控。通过分析疾病相关基因的启动子、增强子或调控元件与转录因子的结合，可以了解这些基因的调控机制和与疾病相关的功能变化。

 

 四、EMSA实验中常见问题及解析 

    01、模糊的带和多条带：迁移时出现模糊的带或多条带，使结果难以解释。

    解决方法：

    ● 检查电泳条件，确保电场强度和运行时间适中。

    ● 调整凝胶浓度，以获得更好的分辨率。

    ● 可能需要优化核酸探针或蛋白的浓度，以获得清晰的带。

 

    02、没有带：没有观察到蛋白-核酸复合物的迁移带。

    解决方法：

    ● 检查是否添加了足够的蛋白或核酸样本。

    ● 确保实验条件（如缓冲液、温度等）适合特定的蛋白-核酸相互作用。

    ● 可能需要优化反应条件，如延长孵育时间。

 

    03、非特异性结合：蛋白可能非特异性地结合到核酸上，而不是与感兴趣的序列结合。

    解决方法：

    ● 使用比赛实验，添加过量的非标的核酸，以验证观察到的迁移是否是特异性的。

    ● 可能需要优化反应条件或尝试更严格的条件以增加特异性。

 

    04、蛋白沉淀不完全：有时，不是所有的蛋白都与核酸结合或从凝胶中转移。

    解决方法：

    ● 确保反应时间足够长，以确保完全的结合。

    ● 使用更高的核酸或蛋白浓度，以提高复合物形成的机会。

    ● 考虑改变缓冲液和离心的条件以改善复合物的沉淀。

 

    05、核酸或蛋白质质量差：使用的核酸或蛋白质可能不够纯净，影响实验结果。

    解决方法：

    ● 确保使用高质量的核酸和蛋白质。

    ● 进行额外的纯化步骤，如净化柱或凝胶电泳。