肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是肿瘤微环境中数量最多的免疫细胞，对肿瘤的发生发展起到重要调节作用。作者发现了一种与巨噬细胞相关的长非编码RNA（lncRNA），名为MALR，它可以促进食管鳞状细胞癌（ESCC）的进展。TAM通过分泌TNFa上调ESCC细胞中MALR的表达，MALR可以通过激活HIF1a信号通路促进糖酵解和血管生成。在机制上，MALR与ILF3的dsRBD1结构域结合，促进ILF3蛋白的稳定性以及由ILF3介导的液-液相分离（LLPS），从而防止PARN介导的降解，提高HIF1a mRNA的稳定性。如果MALR缺失，基于细胞系的以及患者来源的异种移植肿瘤的生长会被抑制。在临床上，MALR的高表达与HIF1a靶基因的表达正相关，并预示着食管癌患者的预后不良。总的来说，这项研究揭示了MALR/ILF3介导的LLPS在肿瘤微环境重塑中的生理作用，突出了MALR-ILF3-HIF1a轴作为癌症治疗的潜在靶点。

  01  TAMs通过TNFa信号通路上调MALR的表达  
 

    作者首先从与TAMs共培养的ESCC细胞中分离RNA，并进行RNA-seq分析以确定TAM上调的lncRNA。通过比较与TAMs共培养的ESCC细胞和单独培养的ESCC细胞，确定了前20个TAM上调的lncRNA（图1A）。为了进一步缩小候选者范围，作者对ESCC肿瘤组织与其配对的正常组织（N=20）进行了RNA-seq分析，并确定了前20个在肿瘤组织中上调的lncRNA（图1B）。在上调的lncRNA中，只有一个候选者在两组中均出现，这个lncRNA被命名为MALR。

    通过qRT-PCR分析，证实了MALR在ESCC组织（图1C）以及与来自患者的TAMs、M2型巨噬细胞或THP-1细胞共培养的ESCC细胞（KYSE150和TE-11）中上调（图1D-F）。相关性分析显示，ESCC肿瘤组织中MALR的表达与CD68的表达呈正相关，CD68被认为是巨噬细胞的一种特异性标记（图1G）。此外，ESCC患者中MALR高表达者总体生存率和无病生存率较差（图1H和I），这表明MALR是ESCC潜在的预后生物标志物。此外，当与TNFa敲低的TAMs共培养或用中和抗体阻断TNFa时，肿瘤细胞中MALR的上调没有发生显著变化（图1K；补充图S1I），这表明TNFa是导致TAMs诱导MALR表达的主要炎症细胞因子。综上，这些结果表明TAMs通过TNFa信号通路上调MALR的表达。

图1. MALR通过TAMs分泌的TNFa上调

 

  02  MALR通过激活HIF1a通路促进ESCC细胞的恶性表型  

    考虑到MALR可能参与ESCC的恶性发展，作者在两个高表达MALR的细胞系中（TE-15和TE-9）构建了MALR敲除（KO）的ESCC细胞，并进行了RNA-seq分析以确定受MALR调节的靶基因。热图结果表明，在两种ESCC细胞系中，当MALR敲除后HIF1a的表达显著下调（图2A）。据报道，HIF1a在缺氧条件下调控许多基因以刺激糖酵解代谢和血管生成。对TCGA数据的基因集富集分析表明，MALR高表达与缺氧、糖酵解和血管生成呈正相关（图2B）。qRT-PCR分析显示，在缺氧条件下培养的MALR敲除细胞中，HIF1a靶基因的转录显著减少（图2C），这一点也得到了免疫印迹（IB）分析的证实（图2D）。这些数据表明MALR在癌细胞中可能激活HIF1a信号通路。

    MALR的缺失显著削弱了ESCC细胞在缺氧条件下培养时的糖酵解活性和细胞生长（图2E和F；补充图S2B）。VEGF是癌症中关键的促血管生成因子，对癌症进展至关重要。正如ELISA所证实的那样，在缺氧条件下培养24小时后，MALR的缺失显著降低了培养基中VEGF的分泌（图2G）。此外，当人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在从MALR敲除细胞获得的培养基中培养时，管状形成能力显著受损（图2H）。TNFa刺激显著增强了ESCC细胞在缺氧条件下培养时的糖酵解活性、细胞生长和管状形成能力，而这种作用可被MALR敲除所减弱（图2I-K）。综上所述，这些数据表明MALR表达与HIF1a激活之间存在强相关性，并强调了MALR在重编程癌细胞代谢和促进血管生成中的潜在作用。

图2. MALR通过激活HIF1a通路促进ESCC细胞的恶性表型

 

03  ILF3与MALR结合并经历LLPS  

    接下来，作者通过FISH检测和MALR的亚细胞定位发现MALR主要定位于细胞核（图3A和B；补充图S3A）。为了探究MALR在肿瘤进展中的潜在作用和机制，作者进行了RNA pull-down分析，随后通过MS鉴定了与MALR相关的蛋白质，如之前报道的那样，特异性与ILF3结合是正义MALR，而不是反义MALR（图3C）。MALR与ILF3之间的特异性相互作用也通过RIP实验得到证实（图3D；补充图S3B）。进一步的MTRAP实验表明，与阴性对照相比，MS2-MALR和MCP-3FLAG质粒的共表达导致ILF3的明显富集（图3E）。作者还通过ChIRP分析在体内验证了MALR与ILF3的相互作用（图3F）。

    此外，作者进行了CLIP-PCR分析，并鉴定了MALR的T3片段介导了MALR与ILF3的相互作用（图3G）。通过进行ILF3蛋白序列的生物信息学分析，作者发现ILF3的C端高度无序，并包含IDRs（图3H）。研究表明IDRs经常出现在相分离的隔室中，因此作者推测ILF3分子有可能发生LLPS。为了评估与MALR的相互作用是否诱导ILF3发生LLPS，作者将EGFP-ILF3蛋白（绿色）与Alexa Fluor 546-14-UTP标记的MALR（红色）混合。混合后，ILF3和MALR形成了微米大小的液滴（图3I），这在ESCC细胞中通过FISH和IF检测也观察到了（图3J）。FRAP分析进一步证明了ILF3介导的LLPS的动力学特性（图3K；补充影像S1）。如FRAP分析所示，液滴动态地改变，分子在液滴与周围溶液之间进行交换（图3K；补充影像S1）。综上所述，这些结果表明ILF3蛋白能够发生LLPS。

图3. ILF3与MALR结合并经历LLPS

 

  04  MALR促进ILF3蛋白的稳定性和ILF3介导的LLPS  

    随后，作者评估了MALR-ILF3相互作用对ILF3稳定性的功能效应。作者发现在ESCC细胞与巨噬细胞共培养或用TNFa处理后，ILF3的表达增加（图4A；补充图S4A）。具体来说，MALR KO ESCC细胞中ILF3的表达明显减少，但通过蛋白酶体抑制剂MG-132处理可以恢复（图4B），这表明MALR促进ILF3的稳定性。此外，敲除MALR对ESCC细胞中ILF3的稳定性有显著影响，缩短了ESCC细胞中ILF3的半衰期（图4C和D；补充图S4B）。此外，作者在用FLAG标签标记的ILF3表达的细胞中进行了IP试验，用抗FLAG抗体进行IP检测，并通过IB法检测了泛素水平。结果显示，MALR敲除显著增加了泛素化ILF3的水平（图4E）。这些数据表明，MALR是维持ILF3稳定所必需的。为了找出与MALR相互作用所需的ILF3蛋白的结构域，作者测试了几种截短的ILF3蛋白形式并发现ILF3的dsRBD1片段在TE-9细胞中是必需的（图4F）。综上所述，ILF3的dsRBD1片段是MALR-ILF3相互作用和包括ILF3蛋白稳定性、细胞生长在内的关键功能所必需的。

    之前的研究表明，SPOP是一种E3泛素连接酶，通过与dsRBD1片段附近的结构域的物理相互作用来调节ILF3蛋白的稳定性。基于这一发现，作者通过Co-IP实验观察到敲除MALR显著增强了ILF3与SPOP之间的相互作用（图4G），这一结果也得到了Duolink PLA实验的证实（图4H；补充图S4H）。因此，作者的数据表明MALR通过阻止SPOP介导的泛素化来增加ILF3蛋白的稳定性。当ILF3-EGFP蛋白浓度为0.1mmol/L时，在不存在MALR的情况下观察到了液滴的形成（图4I）。此外，正交实验表明ILF3的相分离依赖于MALR的剂量。在存在MALR的情况下，相同蛋白浓度下液滴形成能力显著增强（图4I）。为了进一步探讨MALR对ILF3相分离的影响，作者在ESCC细胞中过表达MALR，发现显著增加了ILF3点状形成（图4J）。MALR KO ESCC细胞中ILF3点状形成受到抑制，这可以通过重新表达FL-MALR来挽救，而在DT3-MALR过表达组中则不是这样（图4K）。这些结果表明，MALR（尤其是T3片段）促进ILF3介导的LLPS形成并促进肿瘤生长。

图4. MALR促进ILF3蛋白的稳定性和ILF3介导的LLPS

 

  05  MALR-ILF3介导的LLPS增加了HIF1a mRNA的稳定性  

    Actinomycin D是一种广泛用于测量mRNA降解率的转录抑制剂，在ESCC细胞中，MALR的缺失降低了HIF1a mRNA的稳定性，而在这些细胞中加入Actinomycin D（图5A；补充图S5B）后也是如此。相反，TNFa处理显著增强了HIF1a mRNA的稳定性，这可以通过在ESCC细胞中敲除MALR来挽救（图5B；补充图S5C）。此外，在MALR KO ESCC细胞中，HIF1a mRNA的稳定性降低可以通过外源性表达WT-ILF3来挽救，但不能通过DIDR-ILF3或DdsRBD1-ILF3来挽救（图5C；补充图S5D）。在MALR KO细胞中，HIF1a mRNA的稳定性降低不能通过与1,6-HD一起使用的WT-ILF3来挽救，却可以通过与对照2,5-HD处理一起使用的WT-ILF3来挽救（图5D；补充图S5E和S5F）。综上所述，这些数据表明MALR-ILF3介导的LLPS在促进HIF1a mRNA稳定性方面起着至关重要的作用。

    如图5E所示，作者推断ILF3介导的LLPS可能阻止HIF1a mRNA与PARN之间的相互作用。敲除MALR显著增加了HIF1a mRNA与PARN的相互作用，这通过RIP-PCR测定得到证实（图5F）。作者进一步测试了ILF3 KO ESCC细胞中HIF1a mRNA与PARN的相互作用，RIP-PCR测定表明，敲除ILF3显著增强了HIF1a mRNA与PARN的相互作用，这可以通过在ESCC细胞中过表达shRNA抗性的WT-ILF3来挽救，但不能通过过表达DIDR-ILF3或用1,6-HD处理来挽救（图5G）。总的来说，这些数据表明，MALR-ILF3介导的LLPS通过防止PARN介导的识别和衰变来维持HIF1a mRNA的稳定性。

    为了进一步研究MALR促进的ILF3相分离对肿瘤细胞恶性行为的影响，作者在MALR KO ESCC细胞中过表达了WT-ILF3或DIDR-ILF3（图5H）。作者发现，在缺氧条件下培养的MALR敲除细胞中，WT-ILF3的过表达显著挽救了HIF1a下游分子表达、ILF3点状形成、糖酵解活性、细胞生长和管状形成，但在DIDR-ILF3过表达组中则不是这样（图5H-L）。这些结果表明，MALR-ILF3介导的LLPS促进ESCC的体外恶性进展。

图5. MALR-ilf3介导的LLPS维持了HIF1a mRNA的稳定性

 

  06  MALR-ILF3介导的LLPS促进ESCC的恶性进展  
    接下来，作者研究了MALR-ILF3-HIF1a轴在体内肿瘤发生中的作用。如图6所示，在ESCC细胞中下调MALR或ILF3显著降低了基于细胞的异种移植肿瘤的生长（图6A和B；补充图S6A和S6B）。此外，Ki-67和CD31（内皮细胞标记）也表明，细胞增殖和血管生成也减少（图6C；补充图S6C）。作者通过IHC和IF染色检测还证实，在异种移植肿瘤组织中，HIF1a表达和ILF3点状形成在MALR或ILF3敲除后显著减少（图6C；补充图S6C）。这些数据与作者在体外的发现一致。作者按照先前报道的方法将ESCC细胞和巨噬细胞注射到NSG小鼠中，增加了异种移植肿瘤的生长、增殖、血管生成和ILF3点状形成，这可以通过在巨噬细胞中消耗TNFa以及在ESCC细胞中消耗MALR或ILF3来消除（图6A-C；补充图S6A-S6C）。值得注意的是，使用MALR抑制剂敲除MALR可显著降低肿瘤生长、血管生成和ILF3点状形成（图6D-H；补充图S6F）。综上所述，这些结果表明MALR在ESCC发展中具有促肿瘤作用。

图6. MALR-ilf3介导的LLPS促进体内肿瘤生长

 

  07  ESCC患者中MALR-ILF3-HIF1a轴的临床相关性  

    为了确定MALR及其上游或下游基因的表达与临床的相关性，作者检查了人类ESCC组织中的它们的表达谱。通过qRT-PCR检测了MALR的表达，并根据中位数表达水平将样本分为MALR-low和MALR-high组。作者进一步通过IHC分析在ESCC组织队列中检查了MALR与TAM标记物（CD68）、肿瘤细胞增殖标记物（Ki-67）和血管生成标记物（CD31）的表达水平之间的相关性（图7A）。MALR-high组表现出较高的CD68、ILF3、HIF1a、Ki-67和CD31表达，而MALR-low组表现出相反的模式（图7B）。值得注意的是，MALR的表达与ESCC组织中ILF3点状的数量呈正相关（图7C）。此外，MALR的表达与HIF1a及其下游基因在ESCC样本中的表达呈正相关（图7D和E）。总之，这些数据表明MALR-ILF3-HIF1a轴在人类癌症的发展中起着重要的作用（图7F）。

图7. ESCC患者中MALR-ILF3-HIF1a轴的临床相关性

 

小结  

    本研究发现lncRNA MALR在食管癌中发挥关键作用。TAMs通过分泌TNFa上调MALR，进而促进糖酵解和血管生成。MALR与ILF3结合增强HIF1a信号通路，促进肿瘤进展。在临床样本中，MALR的高表达与不良预后相关。因此，MALR-ILF3-HIF1a轴可能成为治疗食管癌的潜在靶点。