酵母杂交核心技术：深度Q&A帮你轻松突破实验瓶颈

    酵母杂交技术作为一种强大的分子互作研究工具，已在蛋白质研究领域占据了举足轻重的地位，极大地推动了生命科学基础研究以及医药研发的进程。然而，无论是初涉此领域的科研新手还是经验丰富的研究者，都可能在实施酵母双杂交实验的过程中遇到各种困难和挑战，诸如如何判断互作强度、如何有效排除假阳性或假阴性结果、如何处理自激活等问题，常常成为科研工作中的瓶颈。

    鉴于此，依托我司积累的十余年丰富项目经验，我们精心整理了一系列关于酵母杂交核心技术的深度Q&A，旨在帮助广大科研人员更好地理解和掌握这项关键技术，精准破解实验难题，准确捕捉生物分子间的相互作用，从而顺利推进研究项目。

Q：酵母诱饵该选择全长还是核心区域，各有什么优缺点？

A：

（1）全长：
优点：更接近于自然条件下的环境；
缺点：有时候过于长，导致构建具有一定的难度，更可能的产生自激活现象；
 

（2）预测的核心元件（<20bp）：
优点：核心元件用于后续的EMSA验证试验，对核心位点进行突变验证启动效果是否减弱，相对全长启动子而言突变的区域较少操作更为方便；
缺点：核心元件虽然是启动的核心区域，但是启动子的其他区域也可能是作为辅助元件而存在的，如果缺少这些部分就是非自然条件下的环境，可能产生假阴性；
 

（3）蛋白结构功能域：
优点：能准确的研究出这部分区域是否在全长中行使重要的功能，为同一类型的功能研究具有重要的意义；
缺点：不确定其他功能域是否与它一起行使其他功能，或者需要二者之间的搭配才能行使某一项功能，可能会产生假阴性。

 

Q：如果诱饵可以直接激活报告基因，该如何处理？

A：为保证诱饵蛋白功能的完整性，首先我们会考虑用3’AT/ABA进行背景抑制，但是由于这两种试剂对酵母生长具有较大的毒性，后续可能会影响文库筛选，因此在3’AT超过15mM，ABA超过1200ng/ml时我们会考虑将诱饵蛋白进行截断，通过查阅文献和相关数据库，截去转录激活的区域，但是需要注意的是，截去的这一部分很有可能会影响到互作结果。

Q：如何根据自己的研究需求选择酵母单杂还是双杂？

A：（1）酵母双杂交系统主要用于研究蛋白和蛋白之间的互作。

      （2）酵母单杂交系统主要用于研究DNA和蛋白之间的互作。

Q：膜体系为什么要做功能验证？怎样进行功能验证？

A：膜系统载体的选择主要根据诱饵跨膜的类型进行选择，为验证诱饵载体是否构建正确，能在细胞中形成正常的功能，需要将重组诱饵质粒和猎物载体pOST1-NubI共转化酵母菌株中，通过涂布缺陷型和报告基因平板，如果均生长，说明诱饵和猎物的功能域形成了完整的泛素，激活了报告基因的表达，诱饵构建无误，能够形成正常的定位和功能。

 

Q：用筛出的阳性结果做点对点验证现阴性结果的原因是什么？

A：（1）酵母杂交本身也是存在假阳性的情况，有可能这两个基因根本不互作，合成全长进行验证自然也不会产生互作；

      （2）对于双杂来说一般是两个结构域之间的互作，如果互作的两个基因的结构域恰好处于接触的状态，那么就可以发生相互作用；

      （3）有些互作为瞬时互作，在文库筛选时可能捕捉导了互作，而在两个基因进行单独验证时就显示为阴性；

      （4）有些互作为间接互作，可能需要依靠第三个基因的作用，促进这两个基因的互作；

      （5）有些蛋白在正天然情况下可能为膜蛋白或者是定位在膜上的蛋白，酵母杂交虽然是模拟体内互作，但是与天然状态下的蛋白还是有一定的差距的，为保证两个蛋白在同一空间，诱饵和猎物载体均带有核定位信号，会强行的将他们定位在核内，因此可能会产生假阳性的情况。

Q：如何从验证结果判断两个蛋白是否互作及互作强度？

A：酵母核双杂点对点验证是根据是否激活3个报告基因（MELI、HIS、Ade2）来反推是否有互作，是否激活了报告基因又是根据涂布相应平板的颜色反应及菌落有无及大小来判断，因此我们可以直接根据显蓝的强弱、TDO上斑的多少以及大小、QDO上是否能生长来初步判断互作的强弱。

Q：筛出的阳性结果为什么需要重新合成全长而不是片段做回转验证？

A：（1）片段的序列是基于测序结果得出来的，可能会有突变和缺失的情况，可能不是一个完整的结构域；

      （2）将阳性测序结果进行NCBI数据库检索时，由于为片段式可能会匹配到很多的基因，没有办法确定为哪一个基因，需要进行试验确认才能定位到具体的基因，在进行后续的辅助实验EMSA，pulldown等实验时才有理论依据，否则在发文章时仅凭不能确定基因的片段并不能作为有力的支撑。

Q：酵母杂交发生假阳性的原因及解决方式

A：产生原因：

（1）由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用,或者其激活作用被外来蛋白激活。

（2）AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合，也可以单独激活报告基因的表达。

（3）BD和AD在文库中会有随机碰撞导致空间上的接近，以致下游报告基因的表达。

解决方法：

（1）对于点对点验证来说，可同时将诱饵和猎物进行自激活验证，减少假阳性的判定，但是一旦诱饵和猎物均产生自激活，后续自激活的处理方式（截短）会浪费较多的时间；

（2）由于每个报告基因上游的调控区各不相同，因此用不同的报告基因验证阳性，可用于排除或减少假阳性，这也是我们主要采取的方式；

（3）单杂启动子，我们主要采用将报告基因整合到酵母的染色体上，可以使基因表达水平文档，消除了由于质粒拷贝数变化引起的基因表达水平的波动而造成的假阳性。

Q：什么是均一化和三框文库，对文库质量有什么影响？金开瑞对三框文库是如何处理的？

A：均一化cDNA文库：是指某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中,且在cDNA文库中表达基因对应的cDNA的拷贝数相等或接近。减少冗余转录物的拷贝而增加低丰度转录物的拷贝而构建的cDNA文库。简单说就是降低高峰度的核酸，这样低峰度核酸就会占比高一些。均一化cDNA文库是克服基因转录水平上巨大差异给文库的筛选和分析带来障碍的有效措施，有利于研究基因的表达和分析。

    均一化cDNA文库是克服基因转录水平上巨大差异给文库的筛选和分析带来障碍的有效措施，有利于研究基因的表达和分析。现在，在构建均一化cDNA文库中至少有两种主要的观点。一种是基于复性动力学的原理，高丰度的cDNA在退火下复性速度快，而低丰度的cDNA复性要很长时间，从而可以通过控制复性时间来降低丰度；另一种是基于基因组DNA在拷贝数上具有相对均一化的性质，通过cDNA和DNA的饱和杂交而降低在文库中高拷贝存在的cDNA的丰度。

    三框文库：氨基酸对应三个密码子，文库中CDNA的片段大小是随机的，读码框也是随机的，例如ATG，有可能是从A开始翻译，也有可能是从T或G开始翻译，这种情况下就只会出现一个正确的读码，如果客户感兴趣的基因恰好移码了，这样就会提前终止，筛选也不可能被筛出来。三框通过人为的引入一个和两个碱基，使每个移码的基因都能正确的被读出来。传统的三框文库均是通过引物的方式人为引入突变的，金开瑞采用载体改造的方式在载体上引入三个不同的读码框突变。这样的三框文库构建只用合成一份双链cDNA，cDNA的合成纯化均是在同样的反应条件下进行的，可以完全保证三框文库的片段长度，文库滴度等信息的完全一致性，减少三框文库的差异对筛选结果的影响。

    金开瑞三框文库：传统的三框文库均是通过引物的方式人为引入突变的，金开瑞采用载体改造的方式在载体上引入三个不同的读码框突变。这样的三框文库构建只用合成一份双链cDNA，cDNA的合成纯化均是在同样的反应条件下进行的，可以完全保证三框文库的片段长度，文库滴度等信息的完全一致性，减少三框文库的差异对筛选结果的影响。

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