1+1＞2！深度解析RNA测序数据挖掘逻辑和后期实验设计思路，轻松研获10+ SCI

    RNA，即核糖核酸，是生物体内一种重要的生物大分子，它不仅在遗传信息的传递和表达过程中扮演着关键角色，还在基因表达调控、细胞生长、分化、凋亡等生物学过程中发挥着重要作用。因此，对RNA的研究具有重要的科学意义和应用价值。

    RNA可以根据其功能和结构特点分为多个类别，其中包括mRNA（信使RNA）、tRNA（转运RNA）、rRNA（核糖体RNA）以及非编码RNA（ncRNA）。非编码RNA又可以细分为多种类型，如长链非编码RNA（lncRNA）、微小RNA（miRNA）、环状RNA（circRNA）等。非编码RNA作为基因组中不直接编码蛋白质的RNA分子，近年来受到了广泛的关注，它在调控基因表达、维持染色质结构、影响细胞命运决定及参与多种生物学途径中发挥着不可或缺的作用。本文将以非编码RNA为例，深入讲解RNA测序数据挖掘逻辑和后期实验设计思路。

一般来说，非编码RNA功能研究的主线包含3个主要步骤：

    ● 高通量筛选：采用高通量测序技术（如RNA-Seq）和相应的特异性数据库进行高通量筛选，以获取差异表达的候选RNA。

    ● 候选非编码RNA的确定：在测序得到的非编码RNA中，通常优先选择差异倍数大、表达水平高、且与研究方向相关的。

    ● 功能分析与验证：基于生物信息学预测，设计实验来验证非编码RNA的生物学功能。比如通过实时定量PCR、原位杂交等技术，验证RNA在特定样本或条件下的表达情况。还可以通过RNA pull down、RIP、双荧光素酶等实验技术，检测与目标RNA相互作用的蛋白质或RNA，进一步揭示RNA的生物学功能。然后在动物或细胞模型中验证RNA的功能和调控机制，进一步确认其在生理和病理条件下的重要性。
实践出真知，下面我们一起来看几篇文献案例加深下理解。

案例一
circSEPT9可作为TNBC潜在的生物标志物和治疗靶点

    越来越多的研究表明，环状RNA与许多癌症的发生和发展密切相关。本研究旨在探讨环状RNA circSEPT9在人三阴乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）中的表达、生物学功能及分子机制，并分析其表达调控机制，为其作为TNBC临床诊断和治疗新的分子靶点提供科学依据。通过转录组测序（RNA sequencing, RNA-seq）分析4对TNBC组织和癌旁正常组织，得到差异表达的circRNA表达谱。采用Sanger测序、PCR扩增、RNA酶R消化及放线菌素D处理等方法鉴定circSEPT9。应用实时荧光定量PCR和原位杂交技术检测TNBC患者中circSEPT9的表达，分析其表达与临床病理特征的关系，进一步评价其预后。通过一系列体内外功能实验，包括染色质免疫沉淀（ChIP）、荧光素酶报告基因和RIP分析、RNA pull down等，探讨circSEPT9在TNBC发生发展中的作用及机制。本研究发现E2F1和EIF4A3可能促进circSEPT9的生物发生；证实了 E2F1和EIF4A3介导的circSEPT9能够与miR-637结合促进LIF的表达及激活LIF/Stat3信号通路，进而促进三阴性乳腺癌的发生发展。因此，circSEPT9可作为TNBC潜在的生物标志物和治疗靶点。
 

案例二
circPVT1可被HuR调控，通过miR-30d/e-CCNF通路促进肺鳞癌细胞的增殖

    环状RNA（circRNAs）是一类新型的广泛存在的非编码RNA，可以调控不同的人类疾病，包括癌症的发生发展。然而，关于circRNAs在肺鳞状细胞癌（LUSC）中的潜在机制和临床意义的信息还很少。本研究使用RNA测序（RNA-seq）技术对LUSC组织和健康肺组织中的RNA表达谱进行了分析。qRT-PCR用于分析circPVT1的表达及其与LUSC预后（即生存分析）的关系，并进行了体外和体内实验以评估circPVT1对肿瘤生长的影响。作者运用RNA pull-down实验、质谱分析、双荧光素酶报告基因分析和RNA免疫沉淀实验，以探究circPVT1、HuR、miR-30d/e在LUSC中的相互作用。结果显示circPVT1促进LUSC细胞的增殖。circPVT1可被HuR调控，circPVT1作为miR-30d和miR-30e的竞争性内源性RNA（ceRNA），在减轻miR-30d和miR-30e对其靶基因CCNF的抑制影响方面发挥作用。综上所述，circPVT1通过HuR/circPVT1/miR-30d和miR-30e/CCNF级联通路促进LUSC进展，这使它有望成为LUSC诊断的新型生物标志物或治疗靶点。
 

案例三
circEsyt2通过剪接调控来调节血管平滑肌细胞重构

    冠心病、脑卒中是病人致死、致残的主要原因。然而，其发病机制不完全清楚，临床仍需有效治疗策略。因此，进一步揭示这些疾病发病机制显得尤为重要。血管平滑肌细胞（VSMC）的表型转化是冠心病、脑卒中、高血压等重大心脑血管疾病发生发展的病理生理学基础，如何抑制VSMC从收缩态向分泌态转化成为大家共同关注的科学问题。

    作者从多种VSMC表型转化疾病小鼠模型中筛选出高表达环状RNA-circEsyt2，通过表型研究发现，circEsyt2可促进血管平滑肌细胞增殖、迁移和表型转换等细胞行为。而在小鼠颈动脉损伤模型中，抑制circEsyt2表达可显著减轻损伤后血管的内膜新生，表明circEsyt2具有促进血管重塑的病理生理学功能。进一步研究发现，位于细胞质中的circEsyt2可以直接“吸附”剪接调控因子PCBP1并阻碍其入核，在核内触发p53基因的可变剪接事件，生成p53β,进而发挥调控血管平滑肌表型转换及血管重构的作用。此外，严重狭窄的患者冠脉平滑肌细胞中circEsyt2表达显著升高，进一步提示其与疾病的密切关联。该研究为血管重构性疾病的防治新策略提供理论基础和潜在靶点。

    在探讨了三个非编码文献案例后，我们可以总结出RNA功能研究的常规方案设计，并通过以下流程图来直观地表示：

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参考来源：

● https://www.cqmu.edu.cn/info/1096/4459.htm
● https://doi.org/10.1186/s13046-021-01976-w
● https://www.nsfc.gov.cn/publish/portal0/tab448/info82723.htm
● https://www.researchgate.net/publication/357060325
●https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-020-01183-9