Small but Super: 微小却精准如箭，拥有撼动基因的力量

    RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术，是把与内源mRNA编码区同源的小片段（19~23bp）外源双链RNA导入细胞中，通过一系列细胞内反应引发细胞中相应mRNA的降解，从而导致特定基因表达沉默的一种技术。RNAi技术的重要性得到了国际科学界的广泛认可，它在2001年被《Science》杂志评为最重要的成果之一，在2002年《Nature》杂志被评为年度重大科技成果之一，Craig Mello也因此获得了2006年诺贝尔生理学或医学奖。而siRNA沉默，作为RNAi应用的典范，已经广泛应用于基础科研和临床前研究中。它不仅有助于深入了解基因的功能和调控网络，还为疾病的诊断和治疗开辟了全新的路径。通过设计针对特定基因的siRNA，研究人员能够模拟基因突变或缺失的表型，从而揭示基因在生理和病理过程中的作用，为遗传性疾病、癌症以及病毒感染等治疗策略提供了理论依据和技术支持。

siRNA的应用

图源：https://www.cnki.net/

    siRNA设计与实验的成败息息相关，一个精心设计的siRNA不仅能够高效地沉默目标基因，还能最大限度地减少脱靶效应，确保实验的可靠性和特异性。设计流程始于检索感兴趣的核苷酸序列，并了解各个片段的功能。靶序列通常被选择在一段mRNA序列起始密码子下游第50~100个碱基后面。在设计siRNA时往往会选择符合AA(N19)TT(N，任意碱基)的一段23bp的基序，再从中筛选G/C含量在30%~50%左右的序列。对于那些难以沉默的基因，可能需要采取更复杂的策略，比如设计更长的siRNA或者采用siRNA组合，以多角度攻击目标，提高沉默效率。整体而言，siRNA设计是一个细致且动态的过程，需要根据具体实验目标和基因特性灵活调整，以期达成最佳的沉默效果。

图源：1002-1280(2005)11-0023-06

    一旦设计并合成了高效的siRNA，接下来的挑战便是将其有效地递送到目标细胞中，这一过程被称为转染。siRNA转染是实验中至关重要的一步，其成功率直接影响到基因沉默的效果。注意事项如下：

一、转染注意事项

    ●选择与优化转染试剂：选择与目标细胞兼容性好的转染试剂是基础，而优化试剂用量则是提高转染效率的关键，这将直接影响转染效果和细胞生存状态

    ●控制细胞密度：在细胞处于对数生长期，且密度在70%时左右进行转染，可以最大化转染效率和细胞活力

    ●siRNA与转染试剂的充分结合：制备siRNA-转染试剂复合物时，需确保两者的充分混合形成稳定的复合体，这是提高转染效率的必要条件

    ●细胞与复合物的充分接触：加入siRNA-转染试剂复合物后，可轻柔摇动培养皿使复合物均匀分布

    ●优化转染时间：转染时间需根据细胞特性和实验要求调整，适当的转染时间可以最大化沉默效果，避免细胞损伤

    ●避免使用抗生素：转染过程中应避免使用抗生素，以减少对细胞状态的干扰，保证转染效果的真实反映

    ●妥善保存转染试剂：在正确的条件下储存可以保持转染试剂的活性和稳定性，避免因保存不当导致的转染效率下降

二、评估siRNA沉默效果

    评估siRNA沉默效果也是实验的关键环节，它不仅验证了siRNA设计的有效性，也确保了后续实验结果的可靠性。可以从以下几个维度考虑：

① 核酸水平

    ●荧光定量PCR：通过荧光定量PCR技术，检测目的基因mRNA的表达水平。若siRNA成功沉默目标基因，mRNA的转录量将会减少，从而在结果中表现为Ct值的升高或相对表达量的下降。
 

② 蛋白水平

    ●Western Blotting：通过分离细胞总蛋白，使用特异性抗体进行杂交，然后通过化学发光或显色反应可视化目标蛋白的条带。如果siRNA干扰效果明显，理论上目标蛋白的条带强度会减弱。然而，值得注意的是，WB结果主要反映蛋白水平的变化，而siRNA的直接影响发生在mRNA层面。因此，尽管我们可以确信siRNA在mRNA水平上的有效性，但其对蛋白水平的实际影响可能因多种生物调控机制而有所差异，包括但不限于翻译后修饰、蛋白稳定性调控等。这或许会造成在某些情况下，即便mRNA水平显著下调，蛋白条带强度也可能保持不变或变化不明显。

    ●免疫组织化学/免疫细胞化学：在细胞或组织切片上进行，通过特异性抗体结合目标蛋白，再与荧光或酶标记的二抗反应，最后通过显微镜观察蛋白表达情况。

    ●标记蛋白间接检测：在目的基因前后连接标记蛋白（如绿色荧光蛋白EGFP），通过检测标记蛋白的荧光强度间接反映目的基因的表达量。这种方法适用于表达量较低或难以获得特异性抗体的蛋白。

③ 动物实验或TCID₅₀检测

    ●对于动物病毒，可在给动物攻毒后及时给予siRNA，以动物死亡数作为干扰效果的指标；也可以将病毒进行细胞培养后，给予一定量的siRNA，检测病毒的TCID_50。

    总的来说，siRNA的应用范围涵盖了从基础科研到临床前研究的多个层面，为个性化医疗和靶向治疗策略奠定了坚实的科学基础。随着技术的不断成熟和优化，siRNA作为基因沉默工具的潜力将持续释放，为人类健康事业作出更大贡献。