双荧光素酶报告基因检测是转录调控研究中十分重要的实验手段，主要应用于启动子和转录因子，以及miRNA和其靶基因互作的验证。

    在前几期文章中，我们已经详细解介绍了双荧光素酶的原理、实验流程、常见问题与解答、在不同研究领域的应用等。详情参考如下链接：

干货长图文| 一文读懂并区分双荧光素酶实验（DLR）、双分子荧光互补(BiFC)、荧火素酶互补实验（ LCA）

双荧光素酶实验在植物研究领域的适用性探究

干货|手把手教你做双荧光素酶报告基因检测

知无不“研”| 双荧光素酶常见实验问题及解答，另附详细版视频教学

 

    本期我们将跟您一起，看看实验做完了，我们拿到的实验结果是怎样的，又代表了什么呢？

 

microRNA-靶基因

 

    microRNA与靶基因互作的双荧光素酶实验通常使用pmirGLO载体，这是一款由Promega公司开发的，目前常用的一种商品化双荧光素酶报告载体，如下图所示：

 

（图源：Promega官网）

    将靶基因序列插入到萤火虫荧光素酶序列的3‘UTR区域一同转录成mRNA，若microRNA与靶基因发生了结合，则会使萤火虫荧光素酶的mRNA提前降解或干扰其翻译，最终导致荧光值下降。

 

实验常见分组如下图所示：

 

    NC-mimics：作为microRNA的对照，通常是一段随机的RNA

    microRNA-mimics：化学合成的与microRNA拥有相同序列的RNA

    3’UTR-WT：靶基因原始序列

    3’UTR-MT：将结合位点突变后的靶基因序列

 

    由于NC-mimics通常不会与RNA发生结合，因此第①组与第③组是对照组的作用；

    若microRNA能够与靶基因结合，根据上述原理，第②组荧光值会显著性下降；在此前提下，

    第④组由于突变了结合位点，microRNA无法与突变后的靶基因结合，因此荧光值与第③组无显著性差异。

 

转录因子-启动子

    转录因子与启动子互作的双荧光素酶实验通常使用pGL3-Basic载体，如下图所示：

（图源：Promega官网）

 

    将靶基因序列插入到萤火虫荧光素酶序列的启动子位置一同转录成mRNA，若转录因

    子与启动子发生结合，激活了萤火虫荧光素酶mRNA的转录，则会导致荧光值上调，

    有的蛋白结合到启动子上反而会抑制mRNA的转录，最终导致荧光值下调。

 

实验常见分组如下图所示：

 

    pcDNA3.1：过表达转录因子或其他蛋白的空载质粒

    TF-pcDNA3.1 ：插入了目的蛋白CDS序列的目的蛋白过表达质粒

    promoter-WT：启动子的原始序列

    promoter-MT：将结合位点突变后的启动子序列

    TK：作为内参的海肾荧光表达质粒

 

    第①组与第③组转染的是蛋白空载质粒，起对照组的作用；若转录因子能够与启

动子结合并激活转录，根据上述原理，第②组荧光值会显著性上调，如果过表达的

是抑制转录的蛋白，则荧光值会下调；在此前提下，第④组由于突变了结合位点，

转录因子无法与突变后的启动子结合，因此荧光值与第③组无显著性差异。

 

 

下面让我们来看两个实际的案例：

案例一：microRNA-靶基因

LncRNA HOTAIR promotes the growth and metastasis of gastric cancer by sponging miR-1277-5p and upregulating COL5A1

    本文研究了长链非编码RNA HOTAIR在胃癌发生发展中的作用机制。研究表明，HOTAIR能通过吸附miR-1277-5p并上调COL5A1的表达，促进胃癌细胞的生长和转移。研究还发现，COL5A1与胃癌免疫浸润程度有关，提示COL5A1介导的胃癌细胞增殖可能与调节肿瘤微环境有关。此外，研究构建了一个基于COL5A1的预后预测模型，表明COL5A1可以作为胃癌的预后生物标志物。这项研究为胃癌的治疗提供了新的靶点。

 

在本文中，双荧光素酶实验用于验证 miR-1277-5p 与 HOTAIR 和 COL5A1 的靶向互作关系。

实验步骤：

    ① 报告基因质粒构建：将 HOTAIR 和 COL5A1 的野生型和突变型序列克隆到 pmirGLO 载体中，构建成报告基因质粒。

    ② 转染细胞：将报告基因质粒和 miR-1277-5p mimics/inhibitor共转染到 293T 细胞中。

    ③ 检测荧光素酶活性：使用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性，并以内参基因 Renilla luciferase 活性进行标准化。

Fig. HOTAIR exerted its role in GC by sponging miR-1277-5p and upregulating COL5A1.[1]

n, o Dual-luciferase reporter assay demonstrated that miR-1277-5p indeed interacted with HOTAIR and COL5A1.

 

实验结果：

    HOTAIR-wt + miR-1277-5p mimics组中，荧光素酶活性显著低于其他组别，说明 miR-1277-5p 与 HOTAIR-wt 发生靶向结合，抑制了荧光素酶表达。

    HOTAIR-wt + miR-1277-5p inhibitor组中，荧光素酶活性显著高于其他组别，说明 miR-1277-5p inhibitor抑制了 miR-1277-5p 的功能，从而解除其对荧光素酶表达的抑制。

    HOTAIR-mut + miR-1277-5p mimics组和 HOTAIR-mut + miR-1277-5p inhibitor组中，荧光素酶活性没有显著差异，说明突变型序列不能与 miR-1277-5p 发生靶向结合。

该结果验证了 miR-1277-5p 可以与 HOTAIR 和 COL5A1 发生靶向结合，从而调控其表达。

 

案例二：转录因子-启动子

YY1-mediated reticulocalbin-2 upregulation promotes the hepatocellular carcinoma progression via activating MYC signaling

    该研究探讨了YY1介导的网织蛋白2（RCN2）过表达如何通过激活MYC信号通路促进肝细胞癌（HCC）的发展。研究通过PCR和WB方法检测了患者组织和细胞系中RCN2的表达，并结合公共数据库中HCC患者的临床信息。通过一系列生物学功能实验研究了RCN2在体内外的作用，并利用生物信息学方法确定了RCN2的上下游信号。结果显示，RCN2过表达与HCC患者预后较差有关，且在HCC的增殖、侵袭和迁移中起重要作用。研究发现YY1是RCN2的上游转录因子，可促进RCN2的表达，且RCN2通过MYC信号通路参与HCC进展。此外，RCN2还能降低MYC蛋白的蛋白酶体降解，进而推动HCC的发展。研究还发现，通过沉默MYC可以减弱RCN2在HCC中的影响。总之，该研究强调了RCN2在肿瘤进展中的关键作用，并可能为HCC治疗提供潜在策略。

 

本文中，双荧光素酶实验主要用于验证 YY1 作为 RCN2 上游转录因子的作用。

实验步骤：

    ① 构建报告基因质粒：将 RCN2启动子序列克隆到萤火虫荧光素酶表达载体上，构建成报告基因质粒。

    ② 转染细胞：将构建好的报告基因质粒与 pcDNA3.1-YY1 和空载体质粒共转染 Huh7 细胞。

    ③ 处理细胞：细胞培养 48 小时后，裂解细胞并加入荧光素底物。

    ④ 测定荧光素酶活性： 测定萤火虫荧光素酶活性，并以海肾荧光素酶 (Renilla luciferase) 作为内参基因，进行标准化处理。

 

Figure. RCN2 was regulated directly by the transcription factor YY1. [2]

D. Schematic illustration of YY1 binding site on the wild type and mutant RCN2 promotor. Fluorescence activity in Huh7 cells with RCN2 wildtype and mutant promotor with YY1 pcDNA3.1.

 

实验结果：

    与空载体组相比，pcDNA3.1-YY1 组的萤火虫荧光素酶活性显著升高，而 pcDNA3.1-YY1-MUT 组（突变 YY1 结合序列）的萤火虫荧光素酶活性没有明显变化。

该结果表明 YY1 能够直接结合 RCN2 启动子序列，并激活其转录活性，从而上调 RCN2 的表达

 

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参考文献：

1. LncRNA HOTAIR promotes the growth and metastasis of gastric cancer by sponging miR-1277-5p and upregulating COL5A1. Gastric Cancer, 2020.
2. YY1-mediated reticulocalbin-2 upregulation promotes the hepatocellular carcinoma progression via activating MYC signaling. Am J Cancer Res, 2021.