一文了解 | 酵母双杂交建库原理及流程

如果你想研究以下课题，那一定离不开酵母双杂交建库！！！

1、蛋白质相互作用研究：

    通过将诱饵蛋白与cDNA文库中的猎物蛋白在酵母细胞内共表达，筛选出与诱饵蛋白相互作用的猎物蛋白。

2、蛋白质相互作用网络构建：

    用已知功能的蛋白基因筛选 cDNA 文库，寻找互作蛋白，根据钓到的基因功能推测该新基因作用网络。

3、疾病相关蛋白质研究：

    分析蛋白质的结构、功能、调控和演化，发现新的蛋白质和信号通路，筛选与癌症、神经退行性疾病等人类疾病相关的蛋白质相互作用，为疾病机制研究和药物开发提供重要信息。

    很多科研工作者在上述研究方向中不断深入探索，发表了很多的高分文章，如：最新发表的关于蛋白互作类研究的一篇文章中发现，对植物花青素合成具有重要作用的U-box (PUB) E3泛素连接酶 VvPUB26可以和WRKY 转录因子 VvWRKY24 相互作用，从而促进泛素化和降解过程[1]。唐宏温研究团队通过酵母双杂交技术，构建了涵盖数千种蛋白质相互作用的果蝇蛋白相互作用网络[2]。周雅迪教授通过构建SARS-CoV-2与宿主的蛋白质互作网络，发现了新的病毒与宿主互作关系，并通过药物筛选确定了可能对COVID-19有治疗作用的候选药[3]。这些文章中都涉及到一个重要的实验，那就是酵母双杂交，而酵母建库是酵母双杂交实验中的一个关键环节。

 

一、什么是酵母双杂交建库？

    酵母文库类似于一个储存大量外源基因片段的仓库，它是利用酵母细胞作为载体，将外源基因片段插入到酵母菌内，形成一个包含大量基因片段的集合。我们只需要把待研究的目标基因成功构建到诱饵载体上就能和这个酵母文库进行筛库实验。

 

二、酵母双杂交建库的关键步骤

 

1、总RNA提取：

    从目标组织或细胞中提取总RNA，并通过一系列纯化步骤分离出mRNA。

2、mRNA分离及纯化

    使⽤mRNA purification kit将mRNA从100μg~500μg完整度良好的总RNA中进⾏分离纯化。

3、双链cDNA合成及纯化：

    以mRNA为模板，通过逆转录反应合成cDNA，然后对合成的双链cDNA进行纯化。

4、构建cDNA文库：

    将合成的cDNA与AD（转录激活结构域）载体连接，构建成cDNA文库。这个文库包含了大量的猎物蛋白编码序列。

5、文库转化：

    将构建好的cDNA文库转化入酵母细胞中，使酵母细胞能够表达这些猎物蛋白。

6、文库插入片段鉴定：

    计算出文库库容后，挑单克隆进行菌落PCR，抽样检测文库基因插入片段大小确保文库容量、插入片段大小和克隆阳性率等指标符合要求。

 

三、酵母双杂交建库的优势

1、高通量

    可以同时筛选大量蛋白质之间的相互作用，提高研究效率。

 

2、体内环境

    在真核酵母活细胞内进行筛选，更接近蛋白质在体内的真实相互作用环境。

 

3、灵敏度

    能够发现存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用信号。

 

4、丰富性

    文库来源广泛，可采用不同组织、器官、细胞类型和特殊分化时期材料构建成cDNA文库。

 

您的好帮手——酵母双杂交建库试剂盒

    很多小伙伴不愿意将实验假手于人，想自己来探索整个实验过程，别担心，我们来给您帮忙，金开瑞经过十多年在酵母双杂交方向的深耕，自主研发了酵母双杂交试剂盒，而且试剂盒根据诱饵蛋白的定位分为了核蛋白酵母双杂交建库试剂盒、核/膜蛋白酵母双杂交建库试剂盒以及膜蛋白酵母双杂交建库试剂盒，相对于市面上的同款产品更有针对性，性价比更高。

 

 

优势：

    1、对反转录酶进行了改造，显著增加了反转录酶的热稳定性和半衰期，合成cDNA效率更高，片段长度完整性更好。

    2、该试剂盒通过对PGADT7载体进行了移码突变，形成三个不同的读码框，相对传统以引物的方式引入的突变而言，新型的三框文库构建方式只需要合成一份双链cDNA，可以保证三框文库的片段长度，阳性率，文库滴度等信息的一致性。

    3、引入CCDB自杀基因极大降低了空载的产生，基本实现100%阳性率。

    4.、该试剂盒提供的DH10B是经过了高抗性压力筛选的菌株，配合试剂盒中的最优方法制备的感受态以及对应的仪器工作条件，文库的转化效率能够达到至少1×10^10。

    5.该试剂盒提供的试剂更加齐全，基本不需要再额外购买其他试剂材料。

 

总之，酵母双杂建库试剂盒是蛋白互作实验中不可或缺的工具之一，其应用前景广阔且具有重要意义。

参考文献：

[1]Ting Zhao, Congbo Huang, Na Li, Yaqi Ge, Ling Wang, Yujin Tang, Yuejin Wang, Yan Li, Chaohong Zhang, Ubiquitin ligase VvPUB26 in grapevine promotes proanthocyanidin synthesis and resistance to powdery mildew, Plant Physiology, Volume 195, Issue 4, August 2024, Pages 2891-2910. https://doi.org/10.1093/plphys/kiae249

[2] Tang HW, Spirohn K, Hu Y, Hao T, et.al. Next-generation large-scale binary protein interaction network for Drosophila melanogaster. Nat Commun. 2023 Apr 15;14(1):2162. https://doi.org/10.1038/s41467-023-37876-0

[3] Zhou Y, Liu Y, Gupta S, Paramo MI, et.al. A comprehensive SARS-CoV-2-human protein-protein interactome reveals COVID-19 pathobiology and potential host therapeutic targets. Nat Biotechnol. 2023 Jan;41(1):128-139. https://doi.org/10.1038/s41587-022-01474-0