酵母双杂交建库-试剂盒操作流程解析及常见问题解答

    酵母双杂交建库实验是研究蛋白质相互作用中的一个很重要的实验，首先我们要根据蛋白质的定位，选择不同的建库方式。如果蛋白质定位在细胞核上，是基于GAL4酵母单双杂的系统，使用载体PGADT7进行酵母建库；如果蛋白质是定位在细胞膜上，则是基于分离的泛素（split-ubiquitin）介导的膜蛋白酵母双杂交系统，使用pPR3-N载体进行酵母文库的构建。所以大家一定要学会“对症下药”，才能保证实验顺利进行。

    既然选好了方向，那我们就要开始正式建库啦。有的小伙伴会经常遇到建库失败的问题，别担心，小金不仅给大家提供了超级好用的酵母建库试剂盒，还给你们总结了实验过程中需要注意的关键细节，大家赶紧进来抄作业吧！

 

一、酵母建库实验流程图

 

二、酵母建库实验关键点

1、RNA提取与质量检测（源头把控）

    总RNA起始材料的完整性和纯度是高质量 cDNA 合成的重要元素，一份高纯度的RNA是实验成功的关键，我们可以根据自己的实验材料选择合适的方法提取RNA，确保RNA电泳图中无降解或污染。RNA电泳图如下：

总RNA跑胶示例图
左图总RNA样品是合格的，中间和右图总RNA样品不合格

 

2、mRNA纯化及质检

    建议使⽤经过纯化的mRNA作为起始材料来进⾏单双链合成，因为纯化的mRNA可以排除rRNA和tRNA对下游PCR扩增产⽣的⾮特异性⼲扰，增强⽂库的有效扩增。使用mRNA purification kit将mRNA从100μg~500μg完整度良好的总RNA中进⾏分离纯化。

 

3、第⼀链cDNA的合成

    在配备溶液体系的时候，需要保证RNA的用量，计算方法：X=总RNA加1μg，浓度至少为0.1μg/μL。mRNA至少加0.3μg以上，浓度至少为0.1μg/μL)，在合成单链cDNA后，需保存在-20℃，建议三个月内使用，过期需要重新合成。

总RNA/mRNA样品	XμL
CDSⅢ引物（10μM）	1μL
dNTP Mix(10mM)	1μL
无菌H2O	11-X μL
总体积	13μL

4、第二链 cDNA 的合成

    这步实验中，可以先扩增50 μL体系，合成的双链cDNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认合格后，再将剩下的一链cDNA全部合成二链cDNA 。

 

5、双链cDNA质检和纯化

    使用PCR-Pure Kit纯化合成的双链cDNA，纯化前一定要检查PW buffer试剂中是否加入无水乙醇，若忘记加入，有可能会导致实验失败。双链的合成实验尽量要在一天之内完成，放置时间太久，可能会影响实验效果。

 

6、双链cDNA酶切和分级分离

    酶切过程中要注意，将配备好的酶切体系用移液器轻轻抽打混匀，并且短暂离心确保溶液集中在管底。双链cDNA只需要用Sfi I酶进行单酶切，通常是1μL切2μgDNA，做一次建库需要切10μg的纯化后的双链cDNA，有剩下的可以先保存。

    分离过程中将离心柱反转几次，去除离心柱中的气泡，同时要控制缓冲液通过离心柱中的流速，如果流速太慢或一滴的体积太小，则需重新重悬基质并重复滴注程序直至达到正常参数。

 

7、分选的双链 cDNA小量连接

    连接体系如下，注意cDNA和线性化载体按照3：1的比例添加，连接时间大约是16小时左右（时间不宜过短）。

双链cDNA	两者摩尔比建议3：1
PGADT7-SG1,2,3线性化载体（核体系）或pPR3-NS 1,2,3线性化载体（膜体系）
10 ×T4 DNA Ligase Buffer	1μL
T4 DNA Ligase	1μL
去离子水	补足至10μL

8、小量连接产物纯化与转化

    小量连接转化时，连接产物3μL+97μL DH10B感受态，且小量连接转化只需要鉴定片段长度，所以可以直接涂含有Amp抗生素的小平板，每个涂50-80μL左右。

 

9、转化效率和插入片段大小检测

    我们可以从每个组份扩10个菌，跑一下琼脂糖凝胶电泳，判断一下片段长度是否符合要求，确认合格后方可进行下一步实验。

 

10、分选的双链cDNA组分大量连接

    大量连接一定要用新鲜的DH10B感受态。而且涂板时尽量不要离心，正着培养，避免大肠菌最后扒在板子上刮不下来，1mL 涂1个大平板（玻璃平板倒厚一些会比较容易收库，塑料平板比较薄很容易收不下来）。

 

11、大量连接产物纯化与转化

    连接产物涂板37℃温箱过夜后，需要根据每个平板的克隆数，铺板体积以及稀释因子来计算文库滴度。在获得原始文库菌液时，需要加入等体积的灭菌的50%甘油，保存于﹣80℃冰箱。用如下方法统计文库滴度，克隆数 = cfu/mL 铺板体积 (mL) ×稀释因子（注意 : 由于移液器的误差，2~5 倍的滴度差异是正常的）。

• 每板克隆数 = 100
• 铺板体积 = 0.1 mL
• 稀释因子 = 10^-4
则文库滴度为：

12、插入片段大小和文库容量检测

    挑单克隆进行菌落 PCR，抽样检测文库基因插入片段大小，大量文库鉴定一般扩20个左右，可以选10个送去测序，核对种属是否正确。
 

三、酵母文库检测结果展示

1、试剂盒构建的酵母文库库容量检测结果

2、菌落PCR鉴定结果

核酵母杂交文库构建：文库插入片段PCR鉴定70%在750bp以上，文库的阳性率>90%

核体系：＋：以PGADT7-T为模板
－：以水为模板

膜酵母杂交文库构建：文库插入片段PCR鉴定80%在750bp以上，文库的阳性率>90%

膜体系：＋：以pPR3-N为模板
－：以水为模板

 

四、常见问题与解答

Q1、双链cDNA跑胶条带小于预期大小

    使用的总RNA或者mRNA存在降解、样品不纯、浓度太低等问题。可以通过以下方法解决：

    1、通过琼脂糖凝胶检测总RNA和mRNA的质量，确保质量和纯度均没有问题（如果RNA质量很好，但浓度太低，则使用更多的RNA来进行双链的合成；如果RNA质量不行，则需要重新提取RNA)；

    2、对RNA的稳定性进行检测，如果RNA容易降解，检查所用的离⼼管、tip头等是否有RNase的污染，并换⼀种方法重新提取总RNA；

    3、为了更容易地确定是否是RNA的问题，请使用对照RNA进行平行反应。

 

Q2、双链cDNA产物中存在较多<0.1Kb的条带？

    可能是PCR的循环数太多了，重新使⽤第⼀链产物进⾏第⼆链的合成PCR时减少3~4个循环数。

 

Q3、如何检测文库质量，文库容量低应该怎么解决？

    对于我们提供的大肠杆菌文库甘油菌，可以进行梯度稀释后铺板培养，第二天计算库容量，同时挑取单克隆进行PCR扩增，以判断插入片段长度和空载率。如果检测出文库容量低，有可能是连接效率低，可以通过以下两种方式解决问题：

    1、检查分级分离后双链cDNA的浓度，双链cDNA的浓度应该在100~200 ng/μL的浓度范围内。

    2、按照试剂盒说明书中的连接体系，连接体系中线性化载体和双链产物的配⽐不合适，或者连接体系中这两者所加⼊的量太多均会影响连接效率。

 

Q4、DNA浓度不足，提取的DNA浓度太低，无法满足文库构建的要求。

    可以尝试使用其他DNA提取方法来提高DNA浓度，如酚/氯仿法或商业DNA提取试剂盒。此外，可以使用PCR进行DNA预增强，以增加可用DNA的量。

 

Q5、⽂库插⼊⽚段太⼩?

    如果超过50%的克隆具有较小的插入⽚段（即<0.4kb），则双链cDNA分级分离不成功。

    1、重新合成双链cDNA、纯化后酶切双链cDNA进行分级分离；

    2、严格执行分级分离的实验步骤，例如，在洗涤和洗脱步骤中使用过多或过少的柱缓冲液，或省略⼀个步骤，则柱的分级分离功能将减弱；

    3、不要让柱中的基质在洗涤等步骤中变干,干燥的基体可以从柱壳体的内壁收缩
离开。然后，双链cDNA混合物可以沿着柱的侧面向下流动，使小污染物过快地进入基质主体，并在早期的级分中洗脱；

    4、柱应在室温下储存和使用。如果在4℃下冷却，然后加热到室温使用，可能会形成气泡，从而干扰柱的正常工作；

    5、双链cDNA混合物在柱表面上的极端不均匀沉积会导致双链cDNA与低分子量污染物的低效分离。