【干货】全方位解析GST Pull-down实验

    GST Pull-down实验广泛应用于生物学和医学研究领域，特别是在研究蛋白质相互作用、信号传导途径以及药物靶点筛选等方面。通过该实验，既可以验证两种已知蛋白质之间是否存在直接互作关系（GST Pull-down+WB），也可以用于寻找可能与目标蛋白存在相互作用关系的未知蛋白（GST Pull-down+LC-MS），为深入理解生命活动的分子机制提供重要线索。
 

一、实验原理 

    GST Pull-down实验基本原理是利用DNA重组技术将已知蛋白（探针蛋白）与GST（谷胱甘肽巯基转移酶）融合，形成GST融合蛋白。融合蛋白通过GST与谷胱甘肽（GSH）的高亲和力，将GST融合的蛋白质固定在谷胱甘肽包被的琼脂糖珠上，充当一种“诱饵蛋白”。

    当含有与诱饵蛋白有相互作用的靶标蛋白（目的蛋白）的溶液过柱时，靶标蛋白会被捕获并与诱饵蛋白结合形成复合物，将复合物洗脱后，通过Western blot分析可以证实两种蛋白的相互作用，或者筛选相应的目的蛋白。

图1. GST Pull -down实验原理图

 

二、实验流程 

    1、前期准备：用预冷的1mL PBS洗涤样品（约2 X 10^7个细胞）提取蛋白，并使用WB检测纯化蛋白。

    2、获得磁珠结合诱饵蛋白GST-X

    3、诱饵蛋白结合互作蛋白Y(亦可带除GST之外的其他标签)或总蛋白

    4、与融合蛋白发生相互作用的蛋白被亲和到谷胱甘肽层析柱上

    5、洗脱获得相互作用的蛋白

    6、pull-down后WB验证上样电泳：各取30ul对照组、实验组、Input对照、Input实验进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

图2. GST Pull -down实验流程图

 

 

三、结果解读

 

图3. GST Pull -down实验结果图

    上图是以A-GST为诱饵、HIS-B为猎物进行的pull-down实验（A和B 代表待验证的诱饵和猎物蛋白），包含对照组、实验组以及各自的 Input组，pull down后分别用GST和HIS抗体检测信号；判定实验成功的标准是能够在检测GST信号时，对照泳道检测到 GST标签蛋白，实验泳道检测到A-GST。

input （阳性对照）：

    对照组：加入B-HIS(猎物蛋白)+GST标签蛋白  

    实验组：加入B-HIS(猎物蛋白)+A-GST(诱饵蛋白)

    目的：用相应的抗体检测发现均能检测到两组中的四个蛋白，证明实验体系没有问题，GST标签不会和HIS 猎物蛋白有相互作用。

pull down ：

    对照组：加入B-HIS(猎物蛋白)+GST标签蛋白

    实验组：加入B-HIS(猎物蛋白)+A-GST(诱饵蛋白)

    对照组中：分别使用HIS 抗体和GST抗体进行检测，可以看到使用HIS抗体检测时并未下拉到蛋白，使用GST抗体检测时下拉到GST蛋白，表明B-HIS(猎物蛋白)和GST标签蛋白没有互作。

    实验组中：分别使用HIS 抗体和GST抗体进行检测，使用HIS抗体检测时可以下拉到B-HIS 蛋白，使用GST抗体检测时可以下拉到A-GST蛋白，表明B-HIS 蛋白和A-GST蛋白存在互作。

 

四、实验优缺点 

优点：

    ➢ 可验证蛋白质-蛋白质之间的直接互作；

    ➢ GST标记可把一些难溶蛋白变成可溶蛋白，使实验变得更易操作；

    ➢ GSH谷胱甘肽偶联球珠亲和力强，洗脱纯度高。

缺点：

    ◆ 验证互作是在试管中进行的生化反应，不能够完全反映细胞内蛋白真实互作的状态；

    ◆ 两个非同一定位的蛋白可能因电荷或是强亲和力的原因造成假阳性，需要使用其他方法再次验证，比如Co-IP实验等；

    ◆ 融合表达的GST标签，肽链较长，可能会改变原目的蛋白的原有的折叠结构。

 

五、GST Pull-down实验注意事项

（1）蛋白提取整个过程都在冰上操作，减少高温造成的蛋白降解；超声过程中最好不要有气泡产生，减少蛋白降解，裂解后的总蛋白放在-20℃保存。

（2）制备GST融合蛋白时，应选择合适的载体和诱导条件以获得高质量的可溶性融合蛋白。

（3）在进行蛋白的诱导表达时，可溶性表达温度很重要。当温度过高，载体易形成包涵体，若复性不顺利，蛋白没有活性，会影响后续的实验。故建议进行一个诱导温度的摸索，常见的诱导温度在16℃~25℃。

（4）两种并不互作的DNA结合蛋白可能会因为DNA的存在而出现相互作用的假阳性结果，因此，在进行GST pull-down实验时，加入核酸酶的步骤十分必要。

（5）虽然大多数情况下不会造成影响，但GST标签仍可能会影响蛋白的正确折叠。如果对融合蛋白进行质量控制，会使实验结果更加可信。例如加入核磁共振、X射线晶体分析等方法验证蛋白结构有无变化；通过结合已知互作蛋白验证蛋白功能有无变化等。