细胞内的"GPS"追踪术：揭秘蛋白亚细胞定位的奥秘

    细胞就像一座精密运转的微型城市，细胞核是“市政府”，线粒体是“发电站”，高尔基体是“物流中心”……每个蛋白分子都各司其职，才能维持基础的生命活动。而亚细胞定位研究，就是绘制这张“城市地图”的关键技术，它不仅能揭示疾病的发病机制，还是药物靶点筛选的“指南针”！

 

什么是亚细胞定位？

    亚细胞定位可将某种蛋白或者表达产物定位于细胞中的具体位置，如细胞核内、各种细胞器以及质膜上，从而为理解基因的作用机制提供研究方向。

    将目的基因与荧光蛋白的N端或者C端融合，连接在同一个过表达载体上，通过瞬时转化技术或稳定遗传转化技术（比如农杆菌侵染），使得该融合蛋白在材料细胞内表达，目标蛋白会牵引荧光蛋白一起定位到目标细胞器，在扫描共聚焦显微镜的激光照射下会发出绿色荧光，从而可以精确地定位蛋白质的位置。

 

给蛋白贴上"追踪器"

❖ 验证未知蛋白的“落脚点”：有新发现的蛋白，先看看它定位在细胞哪个角落！

❖ 探究疾病与定位异常的关系：比如，错误定位的蛋白是否导致癌症转移。

❖ 助力药物开发：若药物能修正蛋白的错误定位，或许就是治病良方！

优势：

➤ GFP融合蛋白技术能够直接观察到目标蛋白在细胞内的位置和分布，无需额外的标记或处理步骤，使得实验结果更加直观和易于理解。

➤ GFP蛋白在激发光照射下能够发出强烈的绿色荧光，这使得即使目标蛋白在细胞内的表达量较低，也能够被清晰地观察到。

➤ 与其他可能涉及细胞固定、切片等处理步骤的方法相比，GFP融合蛋白技术可以在活细胞中进行实时观察，避免了因处理过程对细胞造成的损伤和改变。

 

亚细定位marker 如何选择？

    植物亚细胞定位：金开瑞使用的的是PBI121-EGFP和PBI121-mCherry两个载体。将待测蛋白连接到PBI121-EGFP载体上，相应细胞器的Marker基因序列构建至PBI121-mCherry载体上，再转化农杆菌并注射烟草后观察荧光信号。

    动物亚细胞定位：金开瑞使用的是pcDNA3.1-EGFP和pcDNA3.1-mCherry两个载体。待测蛋白连接到pcDNA3.1-EGFP载体上，相应细胞器的Marker基因序列构建至pcDNA3.1-mCherry载体上，转染293T细胞后观察荧光信号。

    mCherry: 红色荧光蛋白，可以和绿色荧光蛋白（GFP）共同标记。

表1. 金开瑞生物亚细胞定位实验中的细胞器Marker信息

 

实验流程

01.在烟草中：

♦基因合成及载体构建

（1）将X基因模板构建到PBI121-EGFP载体上测序验证；

（2）将细胞核Marker基因序列构建至PBI121-mCherry载体上测序验证。

♦质粒转化及烟草注射

（1）种植本氏烟草（Nicotiana benthamiana）：将萌发的本氏烟草（Nicotiana benthamiana）在16 h光照/8 h黑暗，温度28℃，相对湿度70%条件下培养大概4～5周；

（2）合成好的载体转化农杆菌GV3101（pSoup-p19）；

（3）挑取含有目的载体的农杆菌单克隆，在含有10 mL相应抗生素（K+Rif+）的LB液体培养基中扩大培养，28℃，220rpm下大概培养36h~48h。

（4）室温，7000 rpm离心2 min收集菌体，用MES缓冲液（10mL）清洗菌液一次，加入5 mL的MES缓冲液重悬菌体，取稀释十倍的菌液测量OD600的值，调整OD600为1.2~1.6（1.4）左右，等体积混合两种菌液，加入乙酰丁香酮至终浓度为150 μM。摇菌1~1.5h；

（5）计算公式：
混合菌：1.4*摇菌体积=OD值*菌体积*10
单菌：0.7*摇菌体积=OD值*菌体积*10

（6）选取生长期为1个月左右完全伸展的烟草叶片，将混合好的菌液用1 mL注射器(去掉针头)从烟草叶背面进行注射。

（7）室温避光培养36~48h后在激光共聚焦下拍照

（8）菌液组合如下表：

序号	菌液组合
1	GFP+OsMADS57-mCherry（positive control）
2	X-GFP+OsMADS57-mCherry

 

02.在293T细胞中

♦基因合成及载体构建

（1）将目的基因序列构建至pcDNA3.1-EGFP载体上测序验证；

（2）将Marker基因序列构建至pcDNA3.1- mCherry载体上测序验证

♦质粒转染

（1）转染前一天24孔培养板中铺入爬片，接种细胞，使转染时细胞密度在60-70%，培养基为DMEM + 10% FBS；

（2）将目的基因和marker各2μg质粒加入50 μL无血清DMEM培养基中室温孵育5min，将2 μL lipo2000转染试剂加入50 μL无血清DMEM培养基中，将上述两者混合后室温孵育15 min，补加无血清DMEM培养基至500 μL；

（3）吸弃孔中培养基，加入上一步制备的转染复合物500μL，37℃培养4-6h；

（4）吸弃培养基，加入1 mL完全培养基，37℃培养48 h；

（5）细胞用4% 多聚甲醛中固定 10 min；

（6）用 PBS 洗涤细胞 3 次;

（7）载玻片上加抗荧光猝灭剂，指甲油封片;

（8）激光共聚焦显微镜拍照。

（9）质粒转染组合如下表：

序号	转染质粒组合
1	pcDNA3.1-EGFP + STOML3-mCherry（对照组）
2	目的蛋白-EGFP + STOML3-mCherry（实验组）

 

备注：
1.DNA的量： Lipofectamine 2000=1：1
2.细胞密度大约占培养板的60%左右，转染

 

结果解读

01.在烟草中

图1. X蛋白烟草中的亚细胞定位

    明场下拍摄主要是为了显示细胞状态，有活力的原生质体细胞应该是饱满圆润的，变形或破碎的细胞说明此时细胞不是最适状态或细胞已死亡；显示荧光确实是细胞内蛋白表达的，而不是细胞碎片及杂质产生的荧光。

    对照组中：mCherry信号（红色）：在细胞膜上呈现连续、清晰的环状分布，与明场图像（Bright Field）的细胞轮廓高度吻合，验证了实验体系的可靠性，为实验组提供可信的参照基准。

    实验组中：X 蛋白它主要是在细胞膜上有绿色的荧光信号。marker用的是 OsPIP1，是已知的细胞膜水通道蛋白，如果绿色的荧光信号和红色的marker 蛋白的红色荧光信号可以重叠的话，它就会发出黄色的一个荧光信号。我们会发现在Merge完成之后。X蛋白的GFP信号与mCherry-OsPIP1信号在细胞膜上高度重叠（Merge图像中黄色区域），表明X蛋白定位于质膜。

02.在原生质体中

图2. AtWRKY29在漆姑草原生质体中的亚细胞定位(Cha et al., 2019)

 

避坑指南

注意事项：避开这些坑，实验结果更靠谱！

❖对照实验不能少：设置空载体转染组、已知定位的阳性对照蛋白。

❖荧光淬灭要当心：及时拍照，避光保存样本，防止信号衰减。

❖过表达陷阱：过量表达可能造成定位假象，建议内源标记或低浓度转染。

❖活细胞vs固定细胞：固定可能改变定位，活细胞动态观察更真实！

 

参考文献：
Cha O K, Lee J, Lee H S, et al. Optimized protoplast isolation and establishment of transient gene expression system for the Antarctic flowering plant Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 2019, 138(3): 603-607.