Int J Mol Sci | 植物性外泌体样纳米囊泡治疗早期骨关节炎的分离、表征和体外细胞研究

    最近发表在《International Journal of Molecular Sciences》期刊上的一篇题为《Isolation, Characterization, and In Vitro Cell Studies of Plant-Based Exosome-like Nanovesicles for Treatment of Early Osteoarthritis》的文章揭示了葡萄柚汁来源的外泌体样纳米囊泡（GEVs）治疗早期骨关节炎的潜力，为骨关节炎治疗提供了新方向。

一、研究价值

    全球2.4亿人受骨关节炎（OA）影响，现有疗法（如关节置换、药物注射）仅能缓解症状，无法修复软骨或逆转病程。而植物来源细胞外囊泡（Plant-EVs）：具有抗炎、抗氧化、再生潜力，且安全性高、成本低、易规模化生产。本文通过研究葡萄柚来源的外泌体样纳米囊泡（GEVs）通过多途径改善OA样软骨细胞功能，为早期骨关节炎治疗提供了极具潜力的新策略。

二、主要研究思路

01.蛋白质定量（BCA）和纳米颗粒示踪分析 （NTA）

    作者开发并优化了一种用于从葡萄柚中分离、纯化和保存外泌体（GEVs）的技术。从30mL的果汁中分离出了大约10⁹个高度纯化的GEVs，其粒径范围在120到170纳米之间，且干燥前后形态和蛋白质含量无显著影响，使用海藻糖也被证明是 GEVs 的有效稳定剂和防腐剂。

图 1.（A） 对 35 纳米 SEC 色谱柱中的馏分进行二辛可宁酸 （BCA） 蛋白分析后获得的蛋白质浓度的图形表示。（B） NTA 和 BCA 的综合结果;如箭头所示，馏分 3 和 4 被鉴定为具有最高的 EVs纯度。（C） 冷冻干燥对蛋白质浓度的影响。（D） 冷冻干燥对 EVs 浓度的影响。

02.透射电子显微镜

    透射电镜（TEM）用于检测 EV的形态和大小。形态学研究表明，UF-SEC 和冷冻干燥工艺不会改变 EV 的完整性和形态，EV是完整的杯状结构（图 2A、B）。具体来说，EV 似乎通过其磷脂双层保持其典型的杯状形态（图 2B）。此外，所有 EV的大小为30-150 nm，都在外泌体的大小范围内（图 2C）

图 2. EV 的 TEM 图像：（A） 标志性的杯状形态;（B） EVs 的脂质双层结构。（C） 使用 ImageJ 软件从 TEM 图像中测量的 EVs颗粒直径 （n = 11）。

03.软骨细胞摄取外泌体的能力验证

    首先我们需要验证外泌体是否可以进入到软骨细胞，将荧光标记的 EV （PKH67） 与人软骨细胞孵育过夜，并进行免疫组织学处理。共聚焦成像（图3）显示 EV（绿色）被吸收到细胞体（红色）中。

图 3. EVs 的细胞摄取实验。EVs 显示为绿色，b-肌动蛋白显示为红色，细胞核显示为蓝色。对照与荧光染料单独孵育，未显示摄取； EVs（绿色）则被吸收到细胞体（红色）中。

04.不同EV剂量对软骨细胞凋亡的影响

    通过细胞实验证明 GEVs 可以被人软骨细胞内化，且在10^⁸–10^⁹ particles/mL的GEVs显著减少IL-1β诱导的软骨细胞凋亡，且不会影响细胞活力，细胞存活率>99%。

图4. 不同 EV 剂量对健康和 IL-1β 诱导的软骨细胞 50 小时的影响。浓度为 10^⁸–10^⁹  个颗粒/mL 的 EV 对 IL-1β 诱导的细胞凋亡的有益影响。

05.EV对软骨细胞活力的影响

    进行细胞活力试验 （Live/Dead 染色） 以分析 EVs 对人软骨细胞活力的影响。图5表示染色细胞的荧光图像。用高剂量 EV（每毫升10^⁸–10^⁹ 个颗粒）处理的软骨细胞表现出超过 99% 的活力，与未处理的对照细胞相似。

图5. 活/死检测细胞检测的荧光成像：绿色表示活细胞，红色表示死细胞。（A） 健康对照人软骨细胞的活细胞。（B） 用EV 处理的健康人软骨细胞的活细胞。未观察到细胞凋亡。ns = 无统计学意义。

06.EV对细胞迁移的影响

    通过伤口愈合和划痕实验证明GEVs加速软骨细胞愈合和迁移，划痕愈合时间缩短至22小时（对照组25小时），迁移率提升13.6%。

图6. 软骨细胞伤口愈合和划痕实验 （A)：伤口愈合试验所示，将 GEVs 添加到健康和骨关节炎（OA）样软骨细胞中导致细胞迁移活性增强。(B)：在25小时的孵育时间内划痕测定结果的划痕面积减少的图形表示。随着孵育时间的增加，划痕面积的减少变得明显。

07.基因表达

    在体外骨关节炎（OA）模型中，通过qPCR检测GEVs处理的软骨细胞的抗氧化、炎症、软骨生成及分解代谢相关基因。发现GEVs 处理降低了炎症标志物COX2和PTGS2的表达，同时增强了抗氧化基因 SOD2和GPX。此外，GEVs处理下调ADAMTS-5和肥大标志物COL10，同时上调软骨形成标志物 ACAN、COL2 和 SOX9，显示出它们的再生潜力。

图7. qPCR检测GEVs处理前后抗氧化、炎症、软骨生成及分解代谢相关基因与OA细胞相比，EV 处理的 OA 细胞中抗氧化剂（GPX，SOD2） 、炎症（COX2，PTGS2）、软骨生成 （SOX9，COL2，ACAN） 和分解代谢/肥大 （ADAMTS5，COL10）标志物表达的倍数变化。* p < 0.05，** p < 0.01，ACAN （p = 0.03）、COL2 （p = 0.0015）、SOX9 （p = 0.004） 和 SOD2 （p = 0.01）显著上调。

    该研究优化了GEVs的分离、纯化和保存方法，证实其对人软骨细胞的有益作用，具有减轻炎症、增强抗氧化能力和促进软骨再生的潜力，这些结果有可能转化为OA早期的微创和再生产品。不过，目前研究仅基于体外实验，未来需开展体内研究和临床试验，进一步明确其作用机制、安全性、生物利用度和疗效。

文献：Rashidi N, Liu C, Guillot PV, Tamaddon M. Isolation, Characterization, and In Vitro Cell Studies of Plant-Based Exosome-like Nanovesicles for Treatment of Early Osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2025 Feb 28;26(5):2211. doi: 10.3390/ijms26052211.