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抗体纯化方法有哪些？

信息来源：金开瑞作者：genecreate 发布时间：2017-09-12 10:51:42

抗体制备出来之后，需要进一步纯化得到纯的多抗或单抗，既有利于保存也有利于排除杂蛋白对结果的影响。常规用于纯化的材料是腹水和细胞培养上清，而通常经过免疫制备的抗体大多数是IgG的各种亚型，以及少数是IgM，二者电泳条带分步大致如下：

硫酸铵沉淀法

基本原理：高浓度的硫酸铵通过与球蛋白竞争水分子破坏蛋白表明的水化膜，降低球蛋白的溶解性，是分离免疫球蛋白的常用方法，而且不同的免疫球蛋白适宜的硫酸铵浓度也稍有差别，一般用来分离抗体的硫酸铵饱和度在33~50%。

适用于：鼠抗所有亚类、其他种属抗体、任何种属的IgM、IgG、IgA

基本操作：

1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清；

2.加入饱和硫酸铵至终浓度45%，静置沉淀蛋白；

3.沉淀蛋白用最小体积PBS或硼酸盐缓冲液溶解，用PBS或硼酸盐缓冲液透析除盐；

4.过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱，PBS或硼酸盐（含0.02%叠氮钠）缓冲液洗脱；

5.电泳检测分子量大小，分光光度法测定抗体浓度；

6.抗体保存浓度在0.1-30 mg/mL适宜，-20 ℃保存不超过一个月，避免反复冻融。

亲和层析法

基本原理：基因工程改造的protein A和protein G能特异性结合哺乳动物IgG的Fc区段，将protein A和protein G结合到柱料上，通过亲和层析的方式，可将IgG及其亚类与片段纯化出来。

成员介绍：protein A分离自Staphylococcus aureus的细胞壁，分子量42 kDa，由spa基因编码，具有五个同型的免疫球蛋白结合结构域，每个结构域由三个α螺旋构成。

protein A的B结构域

protein A的各个结构域

protein A可结合多数免疫球蛋白的Fc段（尤其是人的IgG1、IgG2、IgG4，豚鼠，猕猴，鼠类IgG2a、兔）以及人VH3家族的Fab段。基因工程改造的protein A通常使用大肠杆菌作为表达宿主，表达产物仍含有五个Fc结合结构域。对其结构上的改造主要是为了增加与多孔性材料的偶联性能，也有的改造protein A含有四个或六个同型Fc结合结构域，另外结构域数目较少的protein A能得到更好的抗体纯化效果。

protein G分离自G Streptococcus的细胞壁，分子量65 kDa，由spg基因编码，可结合抗体的Fc段、Fab段以及血清中的白蛋白。基因工程改造的protein G去掉了与白蛋白的结合位点仅仅保留Fc结合结构域，其结合力较protein A更强。

protein G的B结构域

protein G的各个结构域

还有一种protein A/G蛋白，是基因工程改造产物，是将protein A的4个Fc结合结构域与protein G的2个Fc结合结构域融合表达得到的。protein A/G结合了二者的特性，能结合人和鼠的IgG所有亚型，不结合鼠的IgA、IgM。

①protein A亲和层析

适用于：人（IgG3除外）、兔、豚鼠、猪的抗体；

基本操作：

1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清；

2.调节pH到8.0：腹水以10倍体积pH8.0 PBS稀释、培养上清用pH8.0 PBS透析或强氧化钠调节；

3.过protein A琼脂糖凝胶柱，pH8.0 PBS洗杂；

4.柠檬酸缓冲液洗脱抗体（小鼠IgG1用pH6.5，IgG2a用pH4.5，IgG2b和IgG3用pH3.0），并注意收集管内需加入Tris缓冲液中和滴下的抗体溶液；

5.用PBS透析；

6.电泳检测分子量大小，分光光度法测定抗体浓度。

②protein G亲和层析

与protein A相比，protein G通常情况下在低pH环境下与抗体结合力较强，不过高pH环境下小鼠IgG1和兔、人的抗体在仍可以与protein G结合。

适用于：小鼠IgG1、大鼠抗体、猴抗体、兔抗体、牛抗体、山羊抗体、马抗体、绵羊抗体；

基本操作：

1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清；

2.调节pH到5.0：腹水以10倍体积0.1 M醋酸钠（pH5.0）稀释、培养上清以2倍体积0.1 M醋酸钠（pH5.0）稀释；

3.过protein G柱，0.1 M醋酸钠（pH5.0）洗杂；

4.0.1 M甘氨酸（pH2.8）洗脱抗体，并注意收集管内需加入Tris缓冲液中和滴下的抗体溶液

5.用PBS透析；

6.电泳检测分子量大小，分光光度法测定抗体浓度。

③抗原亲和层析法

抗原亲和纯化一般用在多抗的纯化上，这种纯化方式去掉了血清中那些非特异性结合的抗体分子，得到的抗体分子基本上都是能特异性与抗原结合的。抗原亲和纯化需要先将抗原偶联到柱料上，然后通过亲和层析的方式去除非特异性抗体及杂蛋白，得到特异性抗体。通常采用的柱料为溴化氢预处理和N-羟基琥珀酰亚胺预处理琼脂糖凝胶柱料，前者适合偶联大分子，后者适合偶联小分子物质，在实际操作中还是需要根据情况进行选择。

适用于：多抗抗体的纯化，对抗体亚型无限制

偶联基本操作：

1.抗原用0.1 M NaHCO3偶联缓冲液（含0.5 M NaCl，pH8.3）溶解；

2.用1 mM稀盐酸洗涤柱料；

3.混合抗原和柱料，在室温混悬1 h或者4 ℃混悬过夜；

4.用偶联缓冲液洗涤偶联的柱料去掉未偶联抗原；

5.用0.1 M Tris（pH8.0）或1 M乙醇胺（pH8.0）处理偶联柱料2 h以封闭未偶联位点；

6.依次用0.1 M醋酸钠缓冲液（含0.5 M NaCl，pH4.0）和0.1 M Tris（含0.5 M NaCl，pH8.0）洗涤偶联柱料五次，重复此操作三遍。

纯化基本操作：

1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清；

2.0.01 M PBS（pH7.4）平衡偶联柱料；

3.抗体样品过柱，0.01 M PBS（pH7.4）洗杂；

4.抗体洗脱液洗脱抗体；

5.用0.01 M PBS（pH7.4）透析；

6.电泳检测分子量大小，分光光度法测定抗体浓度。

随着技术的发展抗体的纯化方法越来越多，例如分子筛层析、离子交换层析等技术也被用于抗体的纯化，在实际运用中需要根据实验目的及其他因素进行方法的选择。

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