蛋白-核酸互作研究方法

        蛋白质与RNA的相互作用是许多细胞功能的核心，如蛋白质合成、mRNA组装、病毒复制、细胞发育调控等。蛋白-核酸互作是机制研究的重要组成部分，是表现、功能等研究的进一步深化。今天小编以一篇经典文献带你了解蛋白-核酸互作研究方法。

经典文献解读：MYC调控的长链非编码RNA（lncRNAs）在细胞周期调控和肿瘤发生中的作用

基本信息
题目：Role of MYC-Regulated Long Noncoding RNAs in Cell Cycle Regulation and Tumorigenesis
期刊：Journal of the National Cancer Institute (JNCI)
影响因子：12.589
主要技术：RNA pull-down , LC-MS/MS, ChIP, RIP

研究背景
         哺乳动物基因组编码大量的非编码RNA，如microRNAs、piRNAs和lncRNAs。迄今为止，已经注释或鉴定了3万多个lncRNAs。目前已经在几种癌症中鉴定到lncRNAs，在结直肠癌（CRC）中也有一些报道，如CCAT1和CCAT2，但大部分lncRNAs 在CRC中的作用仍然鲜为人知，有待阐明。已知转录因子MYC调节lncRNAs并且与癌细胞增殖和肿瘤发生相关。本文作者利用荧光素酶启动子测定，ChIP，RNA pull-down，缺失图谱测定，LC-MS / MS和RIP等方法手段来探索MYC调控lncRNAs的相关机制。
研究内容及结果
1. 鉴定结直肠癌（CRC）中特异表达的lncRNAs
         作者利用lncRNAs基因芯片来分析正常结肠来源和CRC来源的细胞和组织中的lncRNAs。结果获得30215个蛋白质编码转录本和33045个有注释或已知的lncRNAs。其中在CRC中具有表达差异的蛋白质编码转录本（2212/30215）和lncRNAs(2325/33045)具有相似的比例，均为7%（图1，A和B）。
在2325个差异表达的lncRNAs中，有1265个上调和1060下调（图1C）。作者选取差异倍数大于15倍，P <0.01的差异表达的lncRNAs进行RACE快速扩增, 然后利用qRT-PCR进行验证。结果有4个lncRNAs（CCAT3、CCAT4、CCAT5和CCAT6）在CRC细胞系中上调表达（图1, D-G），CCAT7和CCAT8在CRC细胞系中下调表达（图1，H-I）。利用52个CRC组织和它们临近的正常组织（NATs）进行验证也证实了上述结果（图J-O）。  
2. 进一步鉴定原癌基因MYC调控的CRC相关lncRNAs
        为进一步鉴定由MYC调控的CRC相关lncRNAs的差异表达，作者利用lncRNAs微阵列筛选siMYC处理的CRC派生细胞系中的lncRNAs。结果，在HCT116细胞系和RKO细胞系中分别鉴定到324、863个由MYC调节的lncRNAs（图2B,C）。通过进一步筛选获得MYC上调的三种lncRNAs（AK021907，AC074389.9和KTN1-AS1）（图2D）。这些由MYC调控的lncRNAs 被命名为MYCLos（MYCLos-1，MYCLos-2，MYCLos-3）。
接下来作者研究了由MYC介导调控的MYCLos在各种癌细胞中是否常见。结果表明，在各种癌症类型的细胞中都能观察到MYC介导调控MYCLos，表明MYC介导调控MYCLos在多种类型的癌症中是保守的（图2E-G）。
        为了进一步验证MYC与MYCLos之间的关系，作者还研究了50个人类原发性结直肠癌组织样本(25个正常结肠和25个CRC组织样本)的表达水平，根据MYC表达水平分为4个组(图2H)。通过比较四组中MYCLo-1，-2和-3的表达水平，发现MYCLo-1，-2和-3的表达水平与MYC的表达水平在统计学上显著相关（图2，I-K）。此外，MYCLos在含有MYC过表达的CRC细胞系（图1G）中高度表达（图2A）。为测试MYC是否在转录水平调节MYCLo-1，-2和-3，作者利用荧光素酶报道分子对其进行了测定。结果表明，MYC基因抑制后，MYCLos启动子的活性降低，表明MYC在转录水平上诱导MYCLos表达（图2，L-N）。这些结果表明MYC诱导的MYCLos在转录水平上由转录增强子MYC直接调节。 3. MYC诱导的MYCLos对CDKN1A、CDKN2B等MYC靶基因细胞增殖和表达的影响
       原癌基因MYC通过调节许多细胞周期调节基因来促进细胞的增殖。作者将MYCLo-1，-2或-3以及MYC进行敲除，结果细胞增殖减少（图3A，3B）。敲除MYCLo-1或-2导致细胞在G1期积累，表明MYCLo-1和-2参与G1 / S转换（图3D）。敲除MYCLo-3导致S和G2期细胞积累，表明MYCLo-3在G2期具有调节功能（图3D）。另外作者还鉴定到有190、49和13个细胞周期调节基因分别由MYCLo-1、MYCLo-2和MYCLo-3调控（图3E-F）。  
4. MYCLos介导的CDKN1A和CDKN2B在远端启动子区域的转录调节
        为阐明MYC调控的lncRNAs抑制CDKN1A和CDKN2B表达的机制，作者分别在CDKN1A和CDKN2B基因的启动子中扩增了两个不同的区域，一个包括近端MYC结合（MB）区域，另一个包括没有MB区域的上游区域。然后利用荧光素酶实验对扩增的区域进行启动子测试（图4A和B）。MYC的敲除能诱导无MB区域的上游区域的启动子活性，敲除MYCLo-1或 -2也能诱导激活CDKN1A 和 CDKN2B的启动子活性（图4A,B）。表明MYC不仅在近端区域而且在其启动子的远端区域也可以调控CDKN1A和CDKN2B的转录活性。进一步见鉴定结果表明CDKN1A启动子区域大约在2768bp和2480bp之间对MYCLo-1调节CDKN1A起关键的作用（图4C），CDKN2B启动子区域大约在840bp和570bp之间对MYCLo-2调节CDKN2B起关键作用（图4D）。  
5. MYCLos和RNA结合蛋白（如HuR和hnRNPK）的相互作用
       为研究MYCLos的功能机制，作者使用RNA pull-down实验及质谱分析的方式鉴定RNA-相关的总蛋白（图4E,F）。结果发现10个与MYCLo-1相关的蛋白和8个与MYCLo-2相关的蛋白。通过使用RPISeq软件进行预测，作者还发现HuR-MYCLo-1、hnRNPK-MYCLo-2具有极大相互作用的可能性（图4G，H）。并且通过Western blot验证其相互作用（图4E，F）。
 
        为进一步确认HuR-MYCLo-1、hnRNPK-MYCLo-2之间的相互作用，作者利用RIP实验进行了验证。结果与RNA pull-down实验结果一致，使用HuR抗体的RIP样品中MYCLo-1获得了富集（图4G），使用hnRNPK抗体的RIP样品中MYCLo-2也获得了富集（图4H）。这些结果表明HuR与MYCLo1的交互作用与CDKN1A的转录抑制有关，MYCLo-2通过与hnRNPK相互作用抑制CDKN2B的转录。
 
6. MYCLo-2的致癌功能
        作者利用Northern blot验证了CRC细胞系中MYCLo-2（CCAT6）的过表达。发现大多数CRC组织中MYCLo-2具有非常高的表达水平，在52组相比较的组织样品中有46个CRC组织的MYCLo-2高度表达（图5A）。此外，与正常前列腺来源的细胞相比，MYCLo-2也在前列腺癌（PC）细胞和组织中过表达（图5B, C）。在体外集落形成测定中，敲除MYCLo-2能显着减少细胞和集落的数量，表明MYCLo-2在肿瘤细胞转化中具有作用（图5D）。
另外作者还通过使用MYCLo-2 siRNAs转染肿瘤细胞的体内异种移植，研究了MYCLo-2在肿瘤发生中的抑制作用。结果表明，MYCLo-2损耗对肿瘤的发展有明显的抑制作用（图5E）。上述结果表明，MYCLo-2不仅在肿瘤中过表达，还参与肿瘤发生和肿瘤生长。

文章小结

该文章使用多种技术研究MYC调控lncRNAs的相关机制，揭示了MYCLos通过调节已知的MYC靶基因的表达来参与细胞增殖和细胞周期的调控，另外还发现MYCLo-1与HuR和MYCLo-2与hnRNPK之间的相互作用。进一步研究表明这些相互作用可能参与对MYC靶标（如CDKN1A和CDKN2B）的调控。此外，将MYCLo-2进行敲除能够抑制癌细胞转化和肿瘤发生。这些研究成果对于发现新的癌症靶标和研究MYC相关的发病机制具有重要意义。

文献来源