金开瑞带您走近免疫共沉淀

        免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础,用于研究蛋白质之间相互作用的经典方法,是确定两种蛋白质在完整细胞内相互作用的有效方法。
        其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质A的抗体免疫沉淀A，那么与A在体内结合的蛋白质B也能沉淀下来。目前多用精制的prorein G/A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein G/A就能吸附抗原,以达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
 
一、免疫共沉淀的优点
1、相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；
2、蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；
3、可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
 
二、 免疫共沉淀的缺点
1、可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；
2、两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；
3、必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体。所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
 
三、实验操作的关键点
1、细胞裂解采用温和的裂解条件。不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100）。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。建议不用高浓度的变性剂（0.2%SDS），细胞裂解液中要加各种酶抑制剂。
2、使用的抗体要明确，也可以将几种抗体共同使用。
3、考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲液太少不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。
4、使用对照抗体。单克隆抗体：同一种属的IgG或与要研究的目的蛋白无相互作用的蛋白；兔多克隆抗体：正常兔IgG。
 
四、保证实验结果真实性的关键点
1、确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生。
2、要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。
3、确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。
 
五、常见问题与处理方式
 1、未检测到目的蛋白或者目的蛋白很少
①样品被蛋白酶降解。添加蛋白酶抑制剂，所有的操作在4度以下冰上进行，防止冻融。
②抗体浓度太低。调整抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳的浓度。
③抗体亲和力太低。选用适合于IP的相应抗体。
④IP抗体未与agarose珠子结合。选用合适的珠子，并注意保存防止珠子变质或者干燥。
⑤裂解液严谨度太高。改用严谨度低些的裂解液（按作用剧烈程度来区分: SDS>Trition>NP40>Digitonin>CHAPS)。
⑥受蛋白的亚细胞定位影响。重新选择裂解液配方以释放目的蛋白。
⑦蛋白与蛋白之间的相互作用太弱或者不太稳定。选择亲和力更高的抗体以捕获更多的目的蛋白从而捕获更多的相互作用蛋白。过表达提高目的蛋白的含量，选择目的蛋白或者相互作用蛋白含量高的样品进行免疫共沉淀实验。
⑧目的蛋白大小与IgG的重链和轻链接近，影响检测。使用不同种属的抗体分别进行IP和 WB实验；使用交联剂DSS 将一抗与ProteinA/G-beads 共价偶联后进行免疫沉淀实验。

2、目的蛋白高背景
①在无血清培养液中裂解细胞；
②在免疫沉淀前用proteinA/G珠子预洗除去非特异结合蛋白；
③免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或者去垢剂）。