噬菌体平台的应用

Part I：天然抗体库构建、免疫抗体库构建、多种片段抗体库构建、抗体人源化

1、技术路线

        外周血淋巴细胞/脾细胞提取RNA/gDNAPCR出全套抗体片段（Fab、scFv等）随机重组插入噬菌体外壳蛋白感染大肠杆菌抗体片段展示于噬菌体表面抗原特异性筛选富集有效结合克隆扩增结合力强的克隆。

 

2、技术应用（主要在医学口）

（1）在寄生虫医学中的应用（如疟原虫、吸血虫等），进行诊断试剂与疫苗的开发，例如分子疫苗制备、保护性抗原制备

        筛选抗靶蛋白抗体可变区---研究蛋白分子免疫识别---筛选诊断试剂/筛选新型疫苗

例子：筛选抗寄生虫抗原的鼠源抗体scFv可变区片段，进一步研究抗原结构和功能，后续可以制备治疗用和诊断用的抗体。

优势：人源化的抗体/抗体片段可通过工程菌进行大量生产，降低成本。

（2）在医学微生物中的应用（已获得针对HAV、HBV、HCV、HIV、VZV、RSV、风疹病毒、CMV、流感嗜血杆菌和破伤风毒素、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒糖蛋白、TNF-alpha等的单抗）

作为诊断试剂、治疗药物的开发工具。

成功案例：对病毒性肝炎诊治，对肝炎临床诊断、基因治疗、发病机制研究研究提供工具。
 

（3）细胞内免疫：针对病毒或肿瘤抗原表达

例子：将筛库得到的高亲和力抗体的scFv基因导入哺乳动物细胞，通过表达的抗体与靶抗原结合阻止病毒生成、干扰肿瘤细胞的代谢。
 

（4）血液心血管系统研究

例子：血栓类心血管疾病研究：血栓形成导致多种心血管疾病，使用噬菌体筛库得到的抗人纤维蛋白单链抗体可用于血栓性疾病的定位诊断、导向性溶栓治疗。优势：单链抗体分子量小（抗体的最小活性单位）、组织穿透力强、体内清除快、集中针对目标组织。

例子1：血液类：EPO为治疗贫血多肽药物，筛库得抗EPO单链抗体，用于获得重组buEPO及研发EPO检测试剂盒。

例子2：血液类：构建50AMcAb单链噬菌体抗体库，研发原核表达的血型鉴定抗体试剂；构建抗人红细胞单链抗体scFv，与ABO血型无关，用于快速血凝诊断。
 

（5）自身免疫疾病研究（重症肌无力、Grave’s病、乔本氏甲状腺炎等）

研究人体自身抗体 的分布、基因构建、遗传规律、产生机制及自身抗原 的性质。

优势：容易操作，可大量制备，抗体人源化。已发现的64株IgG类自身抗体中有49株是噬菌体抗体库技术得到的。

其他自身免疫疾病研究：干燥综合征、重症肌无力、原发性胆汁硬化症、系统性红斑狼疮、魏格纳氏肉芽肿。
 

（6）肿瘤研究及药物靶向治疗

利用肿瘤相关抗原TAA或肿瘤特异性抗原TSA从噬菌体抗体库中筛选，得到的单链可变区抗体分子量小，组织渗透性强，可用于体内造影诊断、免疫治疗抗体药物开发。

优势：噬菌体抗体库筛选的TAA TSA抗体具有亲和力强、特异性高的特点，可用于靶向治疗

例子：从HBx（肝癌相关抗原）单抗细胞中克隆重链可变区基因，重组入M13噬菌体，验证表达产物具有活性，然后表达出单链抗体、单域抗体或嵌合抗体，为肝癌导向治疗研究提供基础。
 

（7）弱免疫原性物质的特异性抗体制备

制备一些很难获得的抗体，如特异性识别MHC I类分子-抗原肽复合物的抗体、胸腺上皮抗体、雌激素抗体等。
 

（8）食品安全、环境安全检测

例子1：以致癌物质黄曲霉素偶联物免疫小鼠，制备小鼠源性抗黄曲霉素单链抗体ScFV库，筛选高亲和力抗体，可用于对花生等进行食品安全检测

例子2：以除虫菊酯偶联物免疫小鼠，构建噬菌体抗体文库并筛选抗除虫菊酯的高亲和力抗体，对监测环境中农药残留、提高种植业科学用药具有重要意义

总结：

噬菌体抗体库构建这块，大多应用于医学相关研究，客户主要集中于医院中设立的研发机构，且大多涉及到人源化改造，其次也有些科研用户，比如高校或研究所的医学生物相关专业，研究与疫病、自身免疫等相关科室，会用到动物自身抗体来做研发，另外还有一类，也是目前我们准备研发的项目，前景较大，跟组学相关联，客户在组学这块做完差异蛋白鉴定之后，在众多差异蛋白中无法确定优先做哪些蛋白，但是又想进一步研究蛋白表达差异时，需要制备较多抗体，可借用我们构建的鼠抗体库或者兔抗体库，实现大规模蛋白的抗体筛选，可最大程度的降低成本和周期。

 

Part 2： 噬菌体随机多肽库

1、技术路线

多肽序列设计 DNA序列插入噬菌体外壳蛋白感染大肠杆菌抗体片段展示于噬菌体表面抗原特异性筛选富集有效结合克隆扩增结合力强的克隆。

2、技术应用

（1）蛋白相互作用

        研究互作蛋白间氨基酸残基的特征，为蛋白质相互作用和功能基因组学的研究提供工具。例如对功能蛋白的“热点”-蛋白互作的最小功能域-进行鉴定，鉴定重要生物大分子如生长激素受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）受体的激动剂和拮抗剂，这类多肽定义为热点配体HSPL。

例子1：Pillulta用高度多样性的随机肽库噬菌体文库进行筛选，分离出10个能竞争性结合胰岛素受体的多肽，并且与胰岛素无序列同源性，通过竞争鉴定实验确定了这些多肽在胰岛素分子上的结合位点及对应激活的酶活性类型和激动剂、拮抗剂功效。

例子2：TNF-α和TNF-β具有防御感染的左右，其生物学效应由膜受体TNFR1(p55)和TNFR2(p75)来介导，用TNFR2(p75)筛选肽库分离到了4个与TNFR2特异性结合HSPL肽，其中有3个能诱导靶细胞的细胞毒反应。
 

（2）肿瘤相关抗原研究

        鉴定分析肿瘤细胞或肿瘤血管内皮表达的特异性癌细胞抗原的结构和功能，对肿瘤的早期诊断和靶向治疗有重要意义。例如筛选肿瘤相关抗原、寻找具有治疗作用的靶肽等。

例子1：用胃癌单抗MG7-Ab对随机肽库进行筛选，得到相对保守的表位信息，为研究单抗与胃癌相关抗原MG7-Ag的结合的结构奠定基础

例子2：抗肿瘤单抗分子量大，组织渗透力差且易被肝、单核巨噬细胞系统非特异性吸收，肽类药物可以克服这些缺点。用人B细胞淋巴癌细胞系SUP-88表面独特性进行筛库，得到一系列现行肽基元，其中一些短肽以二聚体或四聚体形式呈递给完整细胞时能激发信号转导诱导细胞凋亡。

例子3：用前列腺癌特意性抗原PSA筛选肽库鉴定到的配体肽与PSA的结合受锌离子影响，有发展为治疗制剂的潜力。
 

（3）疫苗研制

        噬菌体肽库能筛选到一些抗原的模拟表位，这些模拟抗原还具有一定的免疫原性，能刺激机体产生免疫反应，产生的抗体能与真正的病原体上的天然表位反应，这有利于将发现的表位作为人工合成疫苗的一个组分，在疫苗设计方面有广泛的应用前景。

例子：为解决非典型嗜血流感杆菌毒力因子表面蛋白混合寡糖LOS制备疫苗遇到的免疫原型弱的问题，用兔抗LOS筛选肽库，得到4个一致性序列，其中3个与兔抗亲和力高。用筛选得到的3个高亲和力肽免疫兔得到的抗体对染病小鼠模型具有抗体保护性作用。

总结：

        噬菌体随机肽库，最主要的应用，就是研究互作，不管是天然组织、细胞或者蛋白，还是重组的蛋白及合成的多肽，想了解与其互作的克隆序列，进而结合物种内蛋白序列进行分析，确认可能互作的蛋白信息，其次就是获取抗原表位序列，抗原决定簇一般由5-12个aa组成，通过抗体对多肽库的筛选，获得对应表位的序列，为疫苗研发等工作提供依据，前者目前做服务的客户有一些，我们销售同事也可以继续在蛋白互作这个方向开发客户。

 

Part 3 双特异性抗体BsAb

1、技术应用

（1）导向免疫治疗

        双特异性抗体主要应用于肿瘤的治疗中，它一方面能够结合免疫效应细胞表面的激活分子（能激活效应细胞如T细胞、NK细胞）或偶联毒素，另一方面结合肿瘤相关抗原TAA，从而发挥对肿瘤细胞的杀伤作用。

例子1：用长春花碱的BsAb注射入荷瘤小鼠，肿瘤的生长受到明显抑制

例子2：在体外实验中，用抗CD3-抗HIV的BsAb武装的T淋巴细胞能对HIV感染的靶细胞产生显著的细胞毒效应，且不受HIV的制约，所以健康人的T细胞有望用于HIV患者的治疗。

例子3：用抗CD3-抗肿瘤的BsAb与淋巴因子激活的杀伤LAK细胞结合起来治疗神经胶质瘤患者，两年存活率相比于只是用LAK细胞的一组明显升高。
 

（2）免疫学诊断

抗靶抗原-抗标记酶的BsAb能用一步法简化检测流程，在免疫检测方面有优势

例子1：免疫组织学标记过程中，使用BsAb与标记酶分步加样，因为BsAb分子量小，组织穿透力强，故能提高检测灵敏度

例子2：魏巍制备的针对人膀胱移行细胞癌的BsAb具有良好特异性，对正常膀胱粘膜组织和腺癌组织切片均未显色。

例子3：抗HCG和抗脲酶的BsAb在夹心ELISA中HCG最低检出限为25U/L，与相应的酶抗体检测结果相当，此抗体与酶结合物在4 ℃稳定性达数月之久。将抗体与某些酶基因相连，表达出的酶标抗体可直接用于检测和示踪研究

在影像学诊断方面，BsAb能有效提高放射性标记物对病变部位的趋向性，减少对正常组织的损害。

例子4：用放射性碘标记的抗CEA片段分别与单价scFv、scFv二聚体、scFv-CH3微型抗体结合，对LS174T荷瘤无胸腺小鼠进行肿瘤靶向和生物分布研究，scFv-CH3微型抗体的药代动力学和清除特性适中，适合定位显影。

例子5：将CEA/HSG BsAb联合PET和SPECT应用于肺内微转移的人结肠癌裸鼠分子显影中，该CEA/HSG BsAb具有高度靶向定位特性。
 

（3）免疫性疾病治疗中的应用

过敏性疾病中的应用：

例子1：Tam发现IgE/Fcy II BsAb不会引发IgE致敏细胞中组胺的释放，它能阻止引发组胺释放的特定抗原的触发，同时抑制肥大细胞和嗜酸性粒细胞的活化，能应用于过敏性疾病的治疗。

例子2：Lum发现CD3/CMV BsAb能够靶向T细胞，可以用来预防和治疗造血干细胞移植后的巨细胞病毒感染。

总结：

双特异性抗体，主要应用方向也是在靶向治疗上面，双特异性，顾名思义有2个抗体靶向，一个用于定位，一个用于消除，真正做诊断靶向级别的客户，一般不会选择定制，如果只是研发方向，为写文章，这个都是可以做的，所以客户群体相对分散，有意向咨询可再做详细跟进。

 

Part 4 参考文献

1.陈新华, 温浩, 张耀新. 噬菌体抗体库技术的应用现状, 地方病通报. 2001,4(16):92-94.

2.张勇. 基因工程抗体中噬菌体抗体库技术的应用, 生物学杂志. 2002,5(19):35-37.

3.杨乃娣, 詹金彪. 噬菌体抗体库技术及其研究进展, 细胞生物学杂志. 2009,31(5):629-634.

4.肖创清, 黄志红. 双特异性抗体的临床应用进展, 放射免疫学杂志. 2013,26(5):587-589.

5.李芳秋, 朱扣军. 噬菌体展示肽库技术应用的研究进展, 武建国医学研究生学报. 2004,9(17):843-846.