蛋白质组学技术在各领域的解决方案

蛋白质组学技术在农业生物科研领域、疾病机理机制研究、药物研究、海洋环境、植物胁迫机制研究等方面具有广泛应用。蛋白组学的研究通常遵循以下思路：

   图 1 蛋白质组学研究思路                                

一、蛋白质组学在农业生物科研领域的应用

        蛋白质组学技术在农业生物科研领域的应用为作物生长发育、病虫害防治、遗传育种、畜牧兽医学疾病诊断和治疗等方面发挥重要的作用，为现代农业发展开辟新途径。

1 .蛋白质组学在农作物研究中的应用

        农业是我国人口赖以生存的基础，而提高粮食产量和品质则是农业发展的关键。蛋白质组学关键技术在作物遗传育种、品系鉴定、品质改良、逆境胁迫应答等关键环节的应用，为农业作物的进一步开发利用提供巨大的参考价值。蛋白质组学可系统研究农作物在特定环境或某个发育阶段的组织和器官中蛋白质的表达变化，有助于作物发育过程机制的理解。

        Jia等人利用SWATH等技术对四种玉米组织中的蛋白质进行定量分析：包括未成熟雌穗，未成熟雄穗，授粉后20天的幼胚和14日龄幼苗的根。在玉米的4种组织中总共鉴定到4551个蛋白质，其中在雌穗，雄穗，幼胚和幼根中分别鉴定到3916、3707、3702和2871种蛋白质。利用生物信息学技术将蛋白质组和转录组进行关联分析，并且进一步分析组织特异性高表达的基因和蛋白，以了解玉米组织结构和器官发生的调节机制，为研究玉米发育生物学研究提供了新的线索。相关成果2017年发表在Journal of Proteome Research上。

          

图 2 实验流程图                          

文献来源： Jia HT, Sun W, Li MF, et al. An integrated analysis of protein abundance, transcript level and tissue diversity to reveal developmental regulation of maize [J]. J. Proteome Res, December 18, 2017.
 

2.蛋白质组学在食品科学中的应用

        在食品安全研究中，蛋白组学的出现为食品科学的研究指明了方向，同时也为食品科学的研究奠定了良好的发展平台。蛋白质组学在粮油食品、肉类食品、水产食品、乳品食品等方面的应用，不仅可以提高食品安全，并且在改善食品制作以及储存条件的同时，还可以提高食品的口感以及营养程度。

        在热处理过程中，肉类的主要成分蛋白质会发生结构性变形，如氧化、降解、变性和聚集。蛋白质的这些变化对最终肉制品的质量、颜色、嫩度和风味有重要影响，并最终影响适口性和可接受性。Tian等人利用2-DE等技术手段研究了在加热中心温度为72℃时用不同的烹饪方法，例如水浴烹饪-WB、短时欧姆烹饪-STOH和长时间欧姆烹饪-LTOH，对牛肉的颜色、烹饪损失、剪切值和蛋白质组变化的影响。蛋白质组学分析表明，欧姆烹饪的烹饪损失、剪切值显著低于水浴烹饪（P<0.05）。利用2-DE蛋白组学技术成功鉴定到STOH和WB烹饪样品之间的17个差异蛋白质，并鉴定出LTOH和WB样品之间的13个差异蛋白质。大多数差异蛋白是肌原纤维和肌浆蛋白，可能与肉质的变化相关。WB烹饪可改变蛋白质溶解度并降低2-DE图像中的蛋白质斑点强度。应用欧姆烹饪会产生更高质量的牛肉产品，并减少烹饪时间。相关成果2016年发表在Innovative Food Science & Emerging Technologies上。

        

 图3  实验流程图                   

文献来源：Tian X, Wu W, Yu Q, et al. Quality and proteome changes of beef M.longissimus dorsi, cooked using a water bath and ohmic heating process[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2016, 34:259-266.
 

3.蛋白质组学在畜牧兽医领域的应用

        蛋白质组学在畜牧兽医学研究领域应用主要集中在病原致病或耐药机制靶蛋白的筛选、疫苗候选抗原及药物靶标蛋白的筛选、动物遗传育种、品系鉴定、品质改良等方面。

Wang等人基于iTRAQ的LC-MS / MS技术，比较了刚地弓形虫的速殖子（T）、缓殖子孢囊（C）和孢子化卵囊（O）三个不同发育阶段的蛋白质丰度。共鉴定到6285种蛋白质，其中在孢子化卵囊与速殖子，速殖子与缓殖子孢囊以及缓殖子孢囊与孢子化卵囊中分别鉴定到875、656和538个差异蛋白。对差异蛋白进行进一步的GO、KEGG和String分析，发现一些毒力相关因子和核糖体蛋白在整个生命周期的不同阶段表现出不同的表达模式。这些发现对于了解弓形虫的发育生物学具有重要意义，有助于发现新的治疗靶点以更好地控制弓形虫病。相关成果于2017年发表在Frontiers in microbiology上。

       

图4 实验流程图                    

文献来源：Wang Z X, Zhou C X, Elsheikha H M, et al. Proteomic Differences between Developmental Stages of Toxoplasma gondii Revealed by iTRAQ-Based Quantitative Proteomics[J]. Frontiers in Microbiology, 2017, 8:985.

        Qin等人以猪为模型，利用iTRAQ技术研究猪膳食中蛋白质含量的限制（PL）对小肠黏膜蛋白质组学的改变。共鉴定并定量到5275种蛋白质，筛选出了202个差异蛋白。利用生物信息学技术对差异蛋白进行进一步分析并利用WB进行验证，发现PL可以增强空肠黏膜对外来抗原的免疫应答，另外PL可以通过抑制mTOR途径减少氨基酸转运和细胞增殖。研究揭示了PL如何影响肠道生理功能，特别是氨基酸的运输，肠粘膜结构和微环境以及肠道免疫。其中，mTOR信号通路可能在通过感知氨基酸的供给中，在调节肠道生理功能方面起着核心作用。相关成果2016年发表在Scientific Reports上。

             

图 5 实验流程图                                 

 

文献来源：Qin C, Qiu K, Sun W, et al. A proteomic adaptation of small intestinal mucosa in response to dietary protein limitation[J]. Scientific Reports, 2016, 6:36888.
 

二、蛋白质组学在疾病机理机制研究中的应用

        利用非标记定量蛋白质组学技术如：Label-free、SWATH及标记定量蛋白质组学技术iTRAQ、SILAC等蛋白质方法技术手段，可实现对不同样品中的大量蛋白进行大规模的相对定量研究，为实现疾病相关机制的研究提供思路和见解。其图解流程如下：

图6 蛋白质组学在疾病相关机制研究中的图解流程

1. 鉴定疾病生物标志物

        生物标志物(biomarker)是一种能客观测量并评价正常生物过程、病理过程或对药物干预反应的指示物，也是生物体受到损害时的重要预警指标，涉及细胞分子结构和功能的变化，生化代谢过程的变化，生理活动的异常表现，个体、群体或整个生态系统的异常变化等。生物标志物的研究在新药开发、医学诊断、临床研究方面具有重要的价值，有助于提出更有效的诊疗手段，尤其在肿瘤、心血管疾病、糖尿病、神经性失调等慢性疾病与复杂疾病的防控上具有重要的价值。

        肝细胞癌（HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，发病率位居全球第六，全球死亡率位居第三。高频率的早期转移意味着HCC在确诊时通常处于晚期，降低了患者获得及时治愈的可能。因此，通过诸如血清生物标志物的检测来诊断早期HCC是非常重要的。2017年，一篇报道在Oncotarget上的文章，利用iTRAQ蛋白质组学技术手段筛选出乙肝（HBV，n=10）组、肝硬化（LC，n=10）组、肝细胞癌（HCC，n=10）组和健康对照（HC，n=10）组之间的差异表达蛋白，并且对潜在的肝细胞癌标志物进行K均值聚类分析，GO和串联网络分析。最终选取3个肝癌标志物（CD14、GELS和QSOX1）进行WB验证。综合分析后锁定CD14分子进行ELISA实验确证，发现其具有作为早期肝癌诊断标志物的潜能。

图7 实验流程图

文献来源：J Guo, R Jing, et al. Identification of CD14 as a potential biomarker of hepatocellular carcinoma using iTRAQ quantitative proteomics. Oncotarget, 2017, 28;8(37): 62011-62028.

        由动脉粥样硬化引起的心血管疾病（CVD）是引起全球人类死亡的主要原因。目前用于冠心病（CAD）诊断和监测的成像方式和血清学指标主要集中在晚期症状阶段，常发生在不可逆性心肌损伤后，限制了疾病的及时治疗。为解决早期诊断CAD并及时给与干预和预防的问题，Cheow等人利用iTRAQ技术手段对心绞痛组(NMI，n= 20)、急性心肌梗塞组（MI，n=15）和健康对照组（Ctrl，n=14）血浆蛋白进行鉴定和定量，获得371个高置信度的蛋白（FDR <1％，p <0.05），其中包括53个初步筛选的生物标志物。接下来利用MRM技术对初步筛选的生物标志物进行验证，最终筛选得到8个潜在冠心病新型候选生物标志物。相关成果2017发表在Journal of Proteome Research上。

图8 实验流程图

 

文献来源：Cheow E S H, Cheng W C, Yap T, et al. Myocardial injury is distinguished from stable angina by a set of candidate plasma biomarkers identified using iTRAQ/MRM-based approach[J]. Journal of Proteome Research, 2017.
 

2.蛋白质组学技术在癌症研究中的应用

        癌症是世界上最严重的公共健康问题之一。人们已经做了诸多努力来治疗癌症，包括化疗、光动力疗法和光热疗法等直接疗法。然而，这些疗法都面临一个共同问题，那就是对癌细胞杀伤力有限，并且对正常细胞具有细胞毒性。这一矛盾阻碍了这些疗法在癌症治疗中的有效使用。一氧化碳(CO)是一种内源性气体分子，其对细胞凋亡有广泛的影响。CO 的直接使用能对癌细胞产生细胞凋亡作用，同时减少对正常细胞的毒性。2017年一篇报道在Advanced Materials上的文章利用iTRAQ等技术分析了一种能够将内源性CO2转化为CO的新型光催化纳米材料HisAgCCN，并对其良好的生物相容性和抗癌化疗效果进行了阐述。HisAgCCN处理PC-3细胞（人前列腺癌细胞）前后的样品，共鉴定到4052种蛋白质，其中有146个差异表达的蛋白。利用生物信息学技术对差异蛋白进行进一步的GO、KEGG和String分析，并对一些差异表达蛋白进行进一步的表达验证和功能研究，证实了新型纳米材料HisAgCCN可以增强线粒体的生物合成，特异性地增强癌细胞的氧化应激反应。体内研究表明HisAgCCN / DOX联合治疗具有协同抑瘤作用，可为临床癌症治疗提供新的方向。

图9 实验流程图

 

文献来源：Zheng D W, Li B, Li C X, et al. Photocatalyzing CO2 to CO for Enhanced Cancer Therapy[J]. Advanced Materials, 2017, 29(44):1703822.

3.蛋白质组学技术在糖尿病研究中的应用

        已知糖尿病（DM）与不良心脏重塑有关，即使没有冠状动脉疾病，高血压或其他潜在病因存在的情况下，临床心脏功能障碍、临床心力衰竭风险也会增加。Hung等人利用iTRAQ等技术分析研究了老年2型糖尿病（T2DM）小鼠模型组（实验组）与健康对照组小鼠（对照组）的心肌细胞膜蛋白质组学差异。共鉴定到1304个蛋白，并定量了1260个蛋白。亚细胞定位分析注释了735个膜或膜相关蛋白以及315个质膜蛋白，包括179个转运蛋白，30个通道和64个受体。与对照相比，来自T2DM小鼠的心肌细胞中有417种蛋白呈现出差异表达，其中287个蛋白上调、130个蛋白下调。对差异蛋白进行进一步的GO和IPA分析，发现老年T2DM小鼠的心脏收缩功能障碍与能量障碍及细胞骨架紊乱有关。这些发现加深了对糖尿病心肌病的细胞机制理解，并为治疗提供了新的途径。相关研究2017年发表在Journal of Proteome Research上。

图10 实验流程图

 

文献来源：Hung C L, Pan S H, Han C L, et al. Membrane Proteomics of Impaired Energetics and Cytoskeletal Disorganization in Elderly Diet-Induced Diabetic Mice[J]. Journal of Proteome Research, 2017, 16(10).
 

三、蛋白质组学在新药研究中的应用

        新药研发是一个周期长、高风险、高投入、高回报的产业，竞争的焦点在于筛选新药，问题的核心是低成本、高效率地筛选新药。蛋白质组学是从蛋白质整体水平上、从生命本质的层次上研究和发现生命活动的规律。由于疾病的发生与发展、药物的作用大多是在蛋白质水平上进行的，因此，蛋白质组学研究克服了蛋白质表达和基因之间的非线性关系。将蛋白质组应用于新型药物的研发，可通过对疾病与正常细胞中的蛋白质组进行比较，发现可成为药物筛选作用靶标及与疾病相关的蛋白质。

        药靶识别是理解药物作用机制的关键步骤，可以改善药物目前的治疗体系并扩大药物的治疗潜力。Wang等人利用iTRAQ技术研究了一种能有效抑制肿瘤转移的抗癌剂——穿心莲内酯（andrographolide，简称Andro）在活癌细胞中的特异性细胞靶点。iTRAQ实验共定量到291种蛋白质，其中有208个蛋白在统计学上可信度较高。经过进一步严格筛选，最终发现有75个蛋白质可作为Andro的特异靶点。随后的pathway分析表明，Andro可能通过多种靶点和途径发挥其抗癌作用，其中涉及癌细胞死亡途径的靶标有30多个，涉及细胞迁移和转移的靶标有15个，与炎症相关的靶标有20个，与蛋白合成途径相关的靶标有10个。作者发现NF-κB和β-actin是涉及癌细胞转移途径所有靶标蛋白中差异比例最高的两种靶标蛋白质。因此，鉴于它们在肿瘤转移中的关键作用，后期选择这两种蛋白质以进一步验证Andro的抗癌细胞转移作用。WB实验、细胞迁移和侵袭实验发现Andro具有新型抗转移潜力。相关研究2014年发表在Molecular & Cellular Proteomics上。

图11 实验流程图

 

文献来源：Wang J, Tan X F, Nguyen V S, et al. A quantitative chemical proteomics approach to profile the specific cellular targets of andrographolide, a promising anticancer agent that suppresses tumor metastasis.[J]. Molecular & Cellular Proteomics Mcp, 2014, 13(3):876.

四、蛋白质组学在海洋环境中的应用

        蛋白质组学在海洋环境科学研究中有着广泛的应用，特别是生态毒理、环境胁迫与应答、宏蛋白质组等研究方向。

        生态毒理蛋白质组学是从整体的蛋白质水平上，探讨生物在污染物下，细胞蛋白的变化，并阐明污染物的毒性作用及其机制。海洋环境中多环芳香烃（PAH）的污染对海洋生物和人类的生存产生了严重的危险。 Enerstvedt 等人应用Label-free定量蛋白质组学技术研究了大西洋鳕经PHA处理后，血浆蛋白质组变化情况。该项研究中，研究者共设计了10组实验，包括不同的PAH种类及其不同剂量处理实验。实验结果显示：在鉴定到的369种血浆蛋白质中，其中有12种蛋白是在PHA处理中特异存在，可作为候选标志物。从分析出的差异蛋白中发现，上调的11个蛋白主要是免疫球蛋白，这表明大西洋鳕经PHA处理后发生了免疫反应。总之，该研究结果为今后大西洋鳕血浆蛋白组的研究提供了基础，新的血浆蛋白生物标志物的发现为环境监测环芳烃提供了科学依据。相关成果2017年发表在Chemosphere上。

图12 实验流程图

 

文献来源：Enerstvedt K S, Sydnes M O, Pampanin D M. Study of the plasma proteome of Atlantic cod ( Gadus morhua ): Effect of exposure to two PAHs and their corresponding diols[J]. Chemosphere, 2017, 183:294-304.
 

五、蛋白质组学在植物胁迫机制中的应用

        盐胁迫是对植物非常重要的一种非生物胁迫，对植物的整个生命进程产生影响，例如降低作物的产量，从而形成复杂的自适应机制来应对盐害，这种机制主要体现在光合作用的调节、渗透调节、选择性离子吸收或排斥。Zhang等人应用iTRAQ定量蛋白质组学技术研究了在盐胁迫条件下两种棉花幼苗的耐盐机制。在该项研究中作者选用的两种旱地棉花品种：盐敏感基因型（N）和耐盐基因型(Z)。以NaCl处理的种子生长发育后幼苗为样本，先采用iTRAQ筛选特异性蛋白并在生物信息分析中将蛋白质组学与转录组学进行关联分析，后从RNA 层面进行了验证。作者通过iTRAQ定量蛋白质组学技术从棉花幼苗中共鉴定到2300多个蛋白。其中有100多个差异蛋白，包括58种不同的盐反应蛋白。盐处理后，RNA解旋酶3和原叶绿素还原酶受到明显抑制，而磷酸盐相关的差异蛋白磷酸乙醇胺N-甲基转移酶1被诱导，所有这些蛋白在盐胁迫中发挥重要作用。另外通过关联分析发现有16个差异表达蛋白与差异基因表达相一致，qRT-PCR验证结果与组学结果一致。相关成果2017年发表在Frontiers in Plant Science上。

图13  实验流程图

 

文献来源：Gong W, Xu F, Sun J, et al. iTRAQ-Based Comparative Proteomic Analysis of Seedling Leaves of Two Upland Cotton Genotypes Differing in Salt Tolerance[J]. Frontiers in Plant Science, 2017, 8:2113.

        铅污染是越来越严重的环境问题，持续威胁着作物产量。为了揭示作物对铅毒适应性的分子机制，Zhu等人运用SWATH技术对铅作用后的拟南芥进行了蛋白质组学检测，实验组为铅作用拟南芥幼苗24h，对照组为水作用拟南芥幼苗24h。共鉴定和定量了1719个蛋白，铅作用后有231个蛋白含量发生了变化，其中有151个蛋白表达量上调，80个蛋白表达量下调。功能分类表明大多数Pb响应蛋白参与不同的代谢过程，相反，导致谷胱甘肽、茉莉酸（JA）、硫代葡萄糖苷（GSL）和苯丙素生产的途径被上调。实验表明Pb处理的拟南芥幼苗内源JA产生迅速升高，而JA缺陷型突变体和JA不敏感型突变体表现出Pb对根的超敏反应，暗示JA在Pb响应过程中起重要作用。铅处理后GSL水平显着提高，而在JA突变体中未检测到这种诱导，这表明Pb诱导的GSL积累是JA依赖性的。该研究第一次将SWATH-MS分析技术应用于拟南芥，强调了JA在Pb胁迫过程中潜在的介导作用。相关成果2016年发表在Journal of Proteome Research上。

图14 实验流程图

文献来源：Zhu F Y, Chan W L, Chen M X, et al. SWATH-MS Quantitative Proteomic Investigation Reveals a Role of Jasmonic Acid during Lead Response in Arabidopsis[J]. Journal of Proteome Research, 2016, 15(10):3528.
 

六、蛋白质组学在外泌体研究中的应用

        外泌体（Exosome）也称为多囊泡体，是活细胞分泌来源于晚期核内体的纳米级脂质包裹体结构，直径30-150nm，密度1.13-1.21g/ml，内部包裹了蛋白质、mRNA和microRNA等物质。包括肿瘤细胞在内的几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。外泌体由细胞分泌释放出来，在血液等体液内传播，最后又可被其他细胞吞噬，是细胞间通讯的重要介质。外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳等，而不同组织来源的外泌体在内容物组成和功能方面存在差异，同时这种差异受到细胞外基质和微环境的动态调控。越来越多的证据表明，宿主细胞或肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移。而基于质谱的蛋白质组学是研究外泌体不可或缺的一项技术。将蛋白质组学技术应用于外泌体研究，可以极大地辅助疾病的早期诊断、疾病的治疗、疗效评价和预后分析。

        在肿瘤发生过程中，外泌体已被证明可促进肿瘤血管生成和转移，而其在鼻咽癌（NPC）中的生物学功能尚不清楚。Chan等人利用超速离心法分离来自鼻咽癌细胞系-C666-1和非肿瘤NP细胞系（NP69和NP460）细胞培养上清中的外泌体，通过WB、蔗糖密度梯度和电子显微镜验证外泌体的分子谱和生物物理学特性，并且运用iTRAQ蛋白质组学技术对分离出的C666-1、NP69和NP460外泌体蛋白进行鉴定和定量。从外泌体中共鉴定到640种蛋白质，与对照组相比，C666-1外泌体中有51种蛋白上调、89种蛋白下调。与预期的结果一样，包括ICAM-1和CD44v5在内的促血管生成蛋白上调表达，而血管抑制蛋白TSP-1在C666-1外泌体中下调表达。进一步运用共聚焦显微镜研究和WB实验证实了受体HUVECs中ICAM-1和TSP-1表达的改变是由于外泌体的内化。这些数据表明了鉴定到的血管生成蛋白在外泌体诱导的血管生成过程中具有关键作用，可作为潜在的治疗靶标。相关成果2016年发表在International Journal of Cancer上。

图15  实验流程图

文献来源：Chan Y K, Zhang H, Liu P, et al. Proteomic analysis of exosomes from nasopharyngeal carcinoma cell identifies intercellular transfer of angiogenic proteins.[J]. International Journal of Cancer, 2015, 137(8):1830-1841.