蛋白质组学联合代谢组学分析哺乳动物细胞从静止到增殖的生物过程表征

题目：Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation

蛋白质组学联合代谢组学分析哺乳动物细胞从静止到增殖的生物过程表征

期刊：Cell Reports

影响因子：8.032

主要技术：蛋白质组学、代谢组学

 

研究背景

        正常增殖细胞和肿瘤细胞之间在代谢过程和生理功能上既有相似性又有差异性。在细胞周期中，代谢过程会随着细胞周期的变化而发生改变，但是目前对其发生机制并不清楚。

 

研究结果

1. 细胞增殖周期不同阶段的蛋白表达变化

        作者选择响应IL-3的非恶性鼠pro-B淋巴细胞系FL5.12为研究对象。其中，对照组细胞系在不含IL-3的培养基中培养36小时，实验组细胞系在静止期维持36h后，培养基中加入IL-3刺激细胞增殖，收集不同时期的细胞，以备进行蛋白质组学分析和代谢组学分析（图1）。

图1 收集细胞增殖不同阶段细胞样品

 

        作者选用TMT技术对收集到的不同时期的细胞进行蛋白质组学分析，共定量到6700个蛋白质，其中超过4700个蛋白质在两次生物学重复中均鉴定到，平行性较好的蛋白共2666个，这些重复性好的蛋白质是后续分析的重点。对以上蛋白的聚类分析发现，随着细胞周期进程，蛋白质总体表达趋势呈现逐步的变化。全局表达模式产生两个不同的时间簇，对应于从G0到G1（0h和4h）的过渡阶段和从G1到G2/M（8h到20h）的过渡阶段（图2）。有两组蛋白质具有相反的表达模式，其中一组在G0 / G1中上调，在S / M / G2中下调，另一组则表现出相反的表达模式。随后挑选差异变化大，且跟细胞周期进程有关的60个关键蛋白进行表达趋势聚类分析，结果表明这些蛋白参与到细胞的增殖过程。作者进一步进行GO富集分析，结果显示在参与核仁、线粒体、核糖体的结构成分、ATP结合、翻译起始因子活性、翻译和rRNA加工（p值<0.001）的蛋白在进入细胞周期时大多上调。这表明蛋白质合成相关蛋白在FL5.12细胞由静止到响应IL-3的增殖转变过程中起重要作用，这与先前关于进入第一细胞周期的T细胞活化的研究一致。

图2 蛋白表达层次聚类分析

 

2. 细胞增殖周期不同阶段的蛋白模块分析

         为了进一步加深对细胞周期生理调节的研究，作者通过系统编译已知和预测的蛋白质模块建立了一个大型小鼠蛋白质模块库，借助COMPLEAT tool分析蛋白质组学TMT数据并生成蛋白模块的时间表达谱，对每个阶段的protein modules（功能一致的蛋白归属于同一个protein modules）进行打分和p值分析，找到每个阶段重要protein modules及其参与的生物学过程（图3）。作者使用多个过滤标准对protein modules进行优先级排序（图3B-E），找到了311个有文献支持的protein modules。作者观察到，在G0时期有4个protein module的TCA cycle中的蛋白表达下调，这跟肿瘤细胞线粒体代谢抑制、糖酵解活跃的代谢特征较为类似，同时也促使作者研究与癌症相关的其他代谢途径以及个体代谢酶。

        作者挑选了8种关键代谢途径（TCA cycle、 glycolysis、 de novo pyrimidine biosynthesis、de novo purine biosynthesis、pyrimidine salvage、purine degradation、lipid synthesis、 the urea cycle）进行深入研究，发现TCA循环的下调受到电子传递链（ETC）复合物组分蛋白的整体下调支持，而糖酵解中蛋白恰恰相反，葡萄糖转运抑制剂Txnip被下调，葡萄糖转运蛋白Slc2a1（Glut1）在G0 / G1期转变期间被上调（图4）。

图3 protein modules分析

 

 

图4 TCA循环中下调蛋白和糖酵解中上调蛋白

 

3. 代谢物水平与代谢酶的相关性

        作者更感兴趣的是代谢酶的表达量趋势变化是否反映在它们的代谢产物中。所以，作者又进行了代谢组学分析，6个时间点检测到291种代谢物，最后筛选过滤后得到155种代谢物用于后续分析。层次聚类分析显示代谢组学表达谱在相邻时间点之间是相似的，而且不同于蛋白质组学结果，在G0/G1的转变过程中变化非常显著，代谢组表达量变化出现在S期（T = 12h以后）。作者进一步要验证相关代谢物的表达水平是否与代谢酶的表达水平一致，将可信度高的代谢物映射到上述8个代谢通路中。结果显示绝大多数酶显示出一致的模式，但对于它们的代谢物而言则不如此，代谢物的波动也大于酶水平，如在TCA循环中始终下调的酶显示出可变的代谢物模式（图4A-B），在G0-G1过渡期间，一些代谢物如柠檬酸盐、异柠檬酸盐、α-酮戊二酸盐、富马酸盐和苹果酸盐上调。总而言之，如TCA、糖酵解、脂质代谢通路中，代谢酶的表达与相关代谢产物的表达变化趋势并不是非常一致。而有些代谢物，如核苷酸代谢途径，由于该通路比较细化，和参与该通路的酶有比较好的相关性。

        为了解释酶和代谢物的相对丰度的变化，作者首先获得平均酶和代谢物时间曲线（图5A），TCA循环、糖酵解和脂质合成显示酶与相应代谢物水平之间没有明显的相关性，而其他途径显示正相关或负相关。为了更好地量化这些关系，作者计算了酶丰度谱和代谢物丰度谱之间的绝对Pearson相关系数以及它们在代谢途径中的每一种里面的平均值，然后对于每个途径，通过酶和代谢物的随机取样对平均值进行统计显着性检验。除TCA循环和糖酵解（p值> 0.4）外，酶和代谢物谱之间的相关性总体上好于预期的偶然性（p值<0.09）。对于相关性低的酶和代谢物，最可能的解释是，这些途径中的代谢物也被其他途径中的酶作用。相反，核苷酸代谢中的代谢物更受限于其特定途径，因此表现出较好相关性。

        作者又继续研究一种途径中酶谱与另一种途径中代谢物谱之间的交叉相关性，以了解相互关系（图5B）。作者发现TCA循环中的酶和尿素循环中代谢物正相关，而与糖酵解和TCA循环中的代谢物负相关；糖酵解和TCA循环中的代谢物和嘧啶/嘌呤合成途径中的酶正相关。糖酵解途径中的酶与其他通路的相关性要高于糖酵解通路本身，意味着糖酵解的代谢产物是其他途径如氨基酸和核苷酸合成途径的合成前体。因此作者认为代谢物动力学显示出比酶动力学更复杂的模式。

图5 酶和代谢物的相关性分析

研究结果

        正常增殖细胞和肿瘤细胞之间在代谢和生理上存在相似和不同。一旦细胞进入细胞周期，细胞代谢用于促进各种生物过程。为了将代谢与细胞周期相关联，作者分析了响应于IL-3的非恶性鼠pro-B淋巴细胞系的从静止到增殖的转变，发现了正常增殖细胞与癌细胞共有的多个关键通路代谢酶表达趋势，并且细胞增殖转变的许多代谢特征可见于癌细胞。其研究结果可以就癌症代谢的治疗窗口进行深入研究。

 

解析文献

Ho-Joon Lee , Mark P. Jedrychowski,et al. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports , 2017 , 20 (3) :721-736.

 

参考文献

1. Ting L, Rad R, Gygi SP, Haas W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nature methods. 2011; 8:937–940.

2. Orr SJ, Boutz DR, et al. Proteomic and protein interaction network analysis of human T lymphocytes during cell-cycle entry. Molecular systems biology. 2012; 8:573.

3. Singh SA, Winter D, et al. Co-regulation proteomics reveals substrates and mechanisms of APC/C-dependent degradation. The EMBO journal. 2014; 33:385–399.

4. Coloff JL, Murphy JP, et al. Differential Glutamate Metabolism in Proliferating and Quiescent Mammary Epithelial Cells. Cell Metab. 2016; 23:867–880.